桑葚果渣固態發酵醋有機酸及風味特征分析

吳震，吳煜樟，陳莉，汪沙，李榮源，盧紅梅*

1(貴州大學, 貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州 貴陽，550025)2(貴州大學 釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽，550025)

桑葚又名桑果、桑葚子、桑烏等，口味甜中略酸，富含花青素、多酚、氨基酸、有機酸等營養成分，具有重要的研究與開發價值[1-3]。然而新鮮的桑葚不易存放，通常用于加工果汁、果酒等產品，在此過程中會產生大量的果渣，這些果渣中仍殘留著花青素、多酚等有效物質，多數情況下被用作肥料或作為垃圾傾倒填埋，造成了環境污染和資源浪費[4]。桑葚果樹在生長過程中需要定期剪枝修葉，桑葉作為中醫傳統藥材，含有多糖、黃酮、生物堿等活性成分，因此對桑葚果渣及桑葚果園的廢棄桑葉進行回收并加以利用具有較大的潛在價值和應用前景[5]。

果醋是以果品或果品加工下腳料為主要原料，利用微生物發酵技術釀制的酸性飲品或調味品，具有抗氧化、抗疲勞、降糖降脂等多種功效[6]。果醋的生產主要以鮮果榨汁進行液態發酵獲得，但由于原料的單一性使產品口感和風味受到了一定的限制。采用固態發酵制備果醋可以改善產品風味和色澤，更容易被消費者接受。

本實驗以桑葚果渣為主要原料、桑葉為輔料，采用固態發酵方式制備桑葚果渣醋，以常規液態發酵的桑葚果醋作為對照，對產品的理化指標以及發酵過程中有機酸和揮發性風味物質的變化進行分析，旨在為桑葚副產物資源化利用提供新思路，增加桑葚產品的附加值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

活性干酵母BV818，湖北安琪酵母股份有限公司；巴氏醋酸菌GIM1.158，廣東省微生物菌種保藏中心。

桑葚果汁、果渣、桑葉，貴州省開陽縣某有限公司；桑葉用水清洗，60 ℃條件下烘干并打碎至10～20目備用。

蘆丁標準品，北京索萊寶科技有限公司；酒石酸，成都金山化學試劑有限公司；沒食子酸、乳酸、草酸、檸檬酸、乙酸，天津科密歐化學試劑有限公司；L-蘋果酸、琥珀酸，麥克林生化科技有限公司；試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

Pegasus BT氣相色譜飛行時間質譜儀，美國力可公司；高效液相色譜儀(配置G1329B自動進樣器、G1311C四元低壓梯、G1316A柱溫箱、G1315D二極管陣列紫外-可見光檢測器)、ZORBAX SB-Aq色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，美國安捷倫公司；722 s可見分光光度計，上海欣茂儀器有限公司；ZD-2A自動電位滴定儀，上海大普儀器有限公司；LD-3D離心機，上海上登實驗設備有限公司。

1.3 果醋生產方法

1.3.1 桑葚果醋釀造工藝

固態發酵桑葚果渣醋工藝如下：

液態發酵桑葚果汁醋工藝如下：

1.3.2 操作要點

(1)菌種活化與培養

酵母菌活化：稱取活性干酵母于含糖量為20 g/L的糖水中，在37 ℃下活化25 min。

醋酸菌活化：將斜面保藏菌種接種至基礎培養基(1%葡萄糖，1%酵母膏，3.5%無水乙醇,均為質量分數),在30 ℃，150 r/min條件下培養48 h制備1級種子液，再將1級種子液以10%接種量制備2級種子液。

(2)調配、酒精發酵

果渣組在添加20%(質量分數)桑葚汁后與果汁組分別加入蔗糖調整至總糖含量為14%(質量分數)，以干酵母0.4 g/L的添加量加入酵母活化液，于26 ℃條件下發酵至酒精度和還原糖含量趨于衡定。

(3)醋酸發酵

果渣組添加輔料后與果汁組接入12%(體積分數)醋酸菌種子液，于32 ℃條件下發酵至總酸含量和酒精度趨于衡定(果渣組每24 h攪拌1次醋醅，果汁組采用150 r/min搖瓶發酵)。

(4)淋醋及滅菌[7]

醋醅與水按質量比1∶1.2浸泡7～9 h，再稱取新醋醅浸泡到頭醋液中，反復套淋3次，所得醋液過濾后于70 ℃下滅菌25 min。

1.4 產品品質分析

1.4.1 理化指標測定

總酸含量(以乙酸計)測定[8]參照GB/T 5009.41—2003《食醋衛生標準的分析方法》；不揮發酸含量(以乳酸計)測定[9]參照GB 18187—2000《釀造食醋》；多酚含量[10]采用福林酚法測定，分別以吸光值和沒食子酸濃度為縱坐標和橫坐標建立標準曲線，回歸方程為y=0.012 4x+0.006 6(R2=0.999 0)；黃酮含量[11]參照GB/T 19777—2013《地理標志產品 山西老陳醋》分別以吸光值和蘆丁濃度為縱坐標和橫坐標建立標準曲線，回歸方程為y=0.442 1x+0.003 4(R2=0.999 1)。

1.4.2 有機酸測定[12]

取樣：(1)果醪：添加果汁及蔗糖后的桑葚果渣醪；(2)酒醪：桑葚果渣酒精發酵結束時的醪液；(3)果渣醋：桑葚醋醅所淋醋液；(4)果汁醋：桑葚果酒醋酸發酵結束時醋液。

樣品處理：取樣品10 mL以4 000 r/min離心20 min，取上清液過0.22 μm濾膜待測。測定條件：ZORBAX SB-Aq色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱溫35 ℃，波長210 nm，進樣量10 μL，流速：0.00～4.00 min流速為1.0 mL/min；4.00～10.00 min流速為0.30 mL/min；10.00 min后流速為1.0 mL/min。

選取草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸標準品配成一定濃度梯度混合進樣，以各種有機酸的質量濃度(g/L)為橫坐標，色譜峰的峰面積為縱坐標繪制標準曲線。

1.4.3 揮發性風味物質分析[13-14]

取5.0 mL液體樣品(或5.0 g固體樣品)于頂空瓶中，將老化后的50/30 μm CAR/PDMS/DVB萃取頭插入樣品瓶頂空部分，于50 ℃吸附30 min，吸附后的萃取頭取出后插入氣相色譜進樣口，于250 ℃解吸3 min，同時啟動儀器采集數據。GC條件：DB-Wax色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，載氣為氦氣，進樣口溫度250 ℃，流速1.0 mL/min，起始溫度40 ℃，初始時間3 min；然后以10 ℃/min升至230 ℃，保留5 min。MS條件：發射電流1 mA；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃，接口溫度250 ℃。各種化合物相對含量采用歸一化法計算獲得。

1.5 數據處理

采用Microsoft Office 2016、Origin 2017、SPSS 26.0、RStudio等軟件對數據進行處理、作圖。

2 結果與分析

2.1 桑葚果醋理化指標分析

由表1可知，桑葚果渣醋的總酸含量低于桑葚果汁醋，這可能是由于發酵周期較長所造成的部分損失以及固態釀造的淋醋工藝所致。不揮發酸是衡量食醋品質的一項重要指標，其作用在于調和食醋酸味，桑葚果渣醋中不揮發酸含量高于桑葚果汁醋，可以使果醋口感更加柔和、具有回味[15]。桑葚果渣醋的總酚和總黃酮含量分別達到桑葚果汁醋的1.5和1.7倍，具有顯著性差異(P<0.05)，桑葉是多酚、黃酮等抗氧化物質的有效來源，許多品種的桑葉均表現出較好的抗氧化活性，推測桑葚果渣醋中較高含量的多酚、黃酮與桑葉的添加有關[16]。

表1 不同桑葚果醋理化指標檢測結果 單位：g/L

2.2 桑葚果醋的有機酸組成

表2列舉了桑葚果渣醋不同發酵階段樣品中7種有機酸的含量。在果渣醋的發酵過程中，草酸、酒石酸、蘋果酸含量呈逐漸降低的趨勢，乳酸和檸檬酸含量呈現先升高后降低的趨勢，這與陸燕等[17]在利用桑葚汁制備果醋研究中的變化一致。乙酸在醋酸發酵前變化較小，經過醋酸菌代謝后逐漸增加，最終達到45.83 g/L。琥珀酸是酵母代謝的重要產物，是果渣醋發酵過程中唯一呈上升趨勢的有機酸。

表2 不同桑葚樣品中有機酸含量 單位：g/L

由表2可知，桑葚果渣醋和果汁醋的有機酸組成存在較大差異，果醋的口感與不揮發酸含量及占比存在一定關聯，果渣醋中較高比例的乳酸、檸檬酸、琥珀酸等不揮發酸能調和果醋酸味，減少乙酸對味覺的刺激，使得果醋口感更加柔和[18]。除乙酸和酒石酸外，果渣醋中其他有機酸含量均高于果汁醋，這可能與輔料的添加以及微生物代謝情況的差異有關。

2.3 桑葚果醋及固態發酵過程中風味物質分析

2.3.1 桑葚樣品揮發性風味物質組成及相對含量對比分析

采用GC-MC法從固態發酵的桑葚果醪、酒醪、果渣醋以及液態發酵的桑葚果汁醋樣品中共檢測出264種揮發性風味物質。對4種桑葚樣品各類風味物質進行統計學分析，如圖1所示。

a-種類對比圖；b-相對含量對比圖圖1 桑葚樣品中風味物質分類統計圖Fig.1 Substance classification statistics of flavor substances in mulberry samples

桑葚果醪、酒醪、果渣醋中分別檢測出揮發性風味物質105、145、132種，桑葚果渣醋發酵過程風味物質種類呈先增加后減少的趨勢，這與管冠宇[19]在液態發酵制備桑葚果醋的研究中風味物質變化趨勢一致。酯類物質的相對含量始終占有較高比例，果醋中的酯類多具有較高的氣味活性值(odor activity value，OAV)，如乙酸異戊酯(OAV=56，呈香蕉香味，果渣醋中相對含量為1.81%)、己酸乙酯(OAV=8.7，呈菠蘿香味，果渣醋中相對含量為2.31%)等，均對果醋整體的香氣產生積極的貢獻[20]。果醪與酒醪中酸類物質組成較為接近，醋酸發酵后酸類物質的種類及相對含量明顯增加，其中乙酸從6.92%增加到30.21%，異戊酸、己酸、乳酸等均為這一階段所產生。醇類物質相對含量變化較大，酒精發酵后增加9.59%，這一階段酵母菌產生大量乙醇，同時產生正己醇、異戊醇、異丁醇等大量高級醇副產物；醋酸發酵階段減少11.53%，主要為醋酸菌代謝消耗以及大量醇類物質與酸類物質發生酯化反應造成[21]。醛酮類物質在發酵過程中變化較小，其中苯甲醛、3-羥基-2-丁酮含量較高，苯甲醛貢獻蜜甜香，后者在食醋中較為常見，具有奶香味[22]。烴類物質主要以烷烴為主，酒精發酵后烴類物質增加了33種，隨后減少到12種，但相對含量始終較低。

果汁醋中共檢測出86種揮發性風味物質，以酸類、酯類和醇類物質為主，除醛類外，果渣醋中各類風味物質數量均大于果汁醋，這表明桑葚果渣醋具有更加豐富的香氣成分。LU等[23]對比了以液態發酵和半固態發酵生產胡柚果醋的品質差異，發現半固態發酵樣品風味物質種類更多，推測可能是輔料的添加或微生物代謝情況不同所致。果渣醋的酯類物質種類較果汁醋多出18種，但相對含量卻略低于果汁醋，其中乙酸異戊酯相對含量最高，其次是乙酸苯乙酯；而果汁醋中相對含量最高的是乙酸乙酯，其次是乙酸異戊酯。乙酸異戊酯具有香蕉氣味，乙酸苯乙酯帶有玫瑰香，乙酸乙酯則具有令人愉悅的果香[24]。酸類是果醋的主體風味物質，果渣醋和果汁醋中乙酸相對含量分別為30.21%和30.70%，異戊酸、乳酸等酸類物質可以使果醋酸味更加豐富、柔和。2種果醋中醇類物質呈現種類少、相對含量高的特點，其中苯乙醇、異戊醇含量豐富，苯乙醇賦予果醋玫瑰花香、蜂蜜味，異戊醇則具有白蘭地酒香，它們使得果醋風味濃郁、風格更加突出[25]。

為繼續探究不同桑葚樣品中風味物質結構的異同，利用Upset Plot將桑葚果醪、酒醪、果渣醋以及果汁醋中風味物質的重疊情況進行可視化處理，如圖2所示。

圖2 桑葚樣品中風味物質的Upset plot分析Fig.2 Upset Plot analysis of flavor substances in mulberry samples

在檢測出的264種風味物質當中，4種桑葚樣品共同存在34種風味物質，表明果醪、酒醪、果渣醋和果汁醋的風味特征具有一定的相似性。如果將僅出現在某一樣品中的風味物質稱為“特征成分”，則4種桑葚樣品的特征成分數量呈酒醪>果渣醋>果醪>果汁醋的關系，這與其各自所含風味物質種類的數量關系一致，果渣醋與果汁醋的特征成分分別為50種和16種，進一步說明以固態發酵所得的桑葚果渣醋具有更加復雜的風味物質結構及風格特征。此外，僅果醪、酒醪和果渣醋中共同檢測出的風味物質有辛酸甲酯、苯乙醛等17種，表明這些物質主要來源于桑葚果渣，且發酵過程中保留效果較好。僅果渣醋和果汁醋中共同檢測出的風味物質有正癸醛、α-松油醇等7種，這些物質可能是對桑葚果醋風味特征貢獻較大的成分。

由此可見，以桑葚果渣固態發酵制備果醋相較于液態桑葚醋具有更加豐富的風味物質，因此，本研究繼續探究桑葚果渣醋發酵過程中主要風味物質組成并進行主成分分析(principal component analysis，PCA)。

2.3.2 桑葚果醋固態發酵過程中主要揮發性風味物質的PCA

桑葚果渣固態發酵過程中果醪、酒醪、果渣醋中相對含量大于1%的風味物質(表3)主要有乙酸、乙酸乙酯、苯乙醇等22種成分，對這22種成分進行PCA，結果如圖3所示。

表3 桑葚果渣醋發酵過程中樣品相對含量>1%的風味物質 單位：%

圖3 桑葚發酵過程中樣品主要風味物質的主成分分析Fig.3 PCA of the main flavor substances of samples during the fermentation of mulberry pomace vinegar

由圖3可知，PC1主要與異丁醇、庚酸乙酯、乙醛等物質呈正相關，與乙酸、乳酸、乙酸苯乙酯等呈負相關，其中異丁醇對PC1貢獻最大，發酵過程中呈逐漸下降的趨勢。PC2主要與正己酸乙酯、癸酸乙酯、苯乙醇等物質呈正相關，與己酸、異戊醇、正己醇等呈負相關，其中正己酸乙酯對PC2貢獻最大，發酵過程中呈先升高后降低的趨勢。果醪、酒醪、果渣醋分別位于第四、第一、第三象限，表明發酵過程中樣品的主要風味物質組成產生了較大變化。

3 結論

本試驗采用固態發酵方式，以桑葚果渣為原料、桑葉為輔料制備桑葚果醋。分析表明，桑葚果渣醋的總酸含量為49.84 g/L，不揮發酸、總酚、總黃酮含量分別為7.25、2.72、2.16 g/L，均高于桑葚果汁醋。在果渣醋發酵過程中，草酸、酒石酸、蘋果酸含量降低，琥珀酸含量升高，果渣醋中草酸、乳酸、琥珀酸含量明顯高于果汁醋。采用氣相色譜-質譜聯用技術從桑葚果醪、酒醪、果渣醋以及果汁醋中分別檢測出105、145、132、86種揮發性風味物質，相較于果汁醋，果渣醋的風味物質更加豐富，風格特征更加明顯。主成分分析表明，桑葚果渣醋在不同發酵階段主要風味物質結構存在較大差異。

上述分析結果表明以桑葚果渣及桑葉固態發酵制備果醋具有可行性。此外，實驗中發現桑葚果渣醋中總酚及總黃酮含量均高于桑葚果汁醋，這可能意味著桑葚果渣醋具有更強的抗氧化活性，后續將針對桑葚果渣醋功能性成分以及保健功效進行研究，為桑葚副產物利用提供更充分的理論依據。