枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) BJ3-2發酵薏米高產川芎嗪和溶纖酶體系優化

文安燕，秦禮康, 2*，曾海英，朱怡

1(貴州大學 釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽，550025)2(貴州大學, 西南藥食兩用資源開發利用國家地方聯合工程研究中心，貴州 貴陽，550025)3(貴州省植保站，貴州 貴陽，550001)

發酵是一種通過微生物或酶的作用改變植物基質的理化結構并潛在地提高其生物活性的有效途徑[1]。利用微生物對薏米進行發酵，可改善薏米的組織結構，提高制品營養、風味及食用品質，增強產品功能活性。以紅曲霉發酵薏米，可獲得112.649 mg/kg的洛伐他汀，同時紅曲薏米制品具有抗氧化及降血脂作用[2-3]。YIN等[4]以植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum) NCU137發酵薏米，發現多種營養成分含量增加，風味獨特，黏度特性穩定。WANG等[5]研究發現枯草芽孢桿菌[Bacillussubtilis(natto)]發酵薏米制品改善了高血脂倉鼠的脂質代謝、抗氧化狀態及腸道菌群。課題組前期研究發現，B.subtilisBJ3-2發酵薏米中游離氨基酸、γ-氨基丁酸、總多酚、黃酮、總三萜和薏苡酯含量較原料顯著增加，同時還產生新化合物——川芎嗪[6-7]。

薏米被譽為“世界禾本科植物之王”和藥食同源的“糧藥”之一[8]。薏苡籽粒(薏仁谷)，最外層為堅韌的薏米殼，殼下為種皮層，加工脫殼后即得糙薏米，再精碾去皮拋光即為精薏米，同時產生碎薏米和薏米糠[9]。我國薏米加工技術仍停留在初級階段，多數企業僅限于薏米原料銷售及簡單烘焙制粉；碎薏米作為薏米加工過程中的主要副產物，其主要用于飼料生產[10]。因此，薏米精深加工產品亟待開發。課題組前期借鑒日本納豆研發思路，基于B.subtilisBJ3-2發酵精薏米可高產川芎嗪前期成果，擬以貴州興仁薏米(精薏米、糙薏米和碎薏米)為原料，采用B.subtilisBJ3-2為發酵菌株分別對3種薏米進行不添加前體物質的單一基質發酵，通過單因素及Box-Behnken試驗構建高產川芎嗪和溶纖酶的薏米發酵體系，為薏米高值化加工提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

薏米，貴州興仁農業發展有限公司；黃豆，合力超市；B.subtilisBJ3-2，貴州大學吳擁軍教授贈送；川芎嗪、尿激酶，Sigma；其余相關生理生化試驗所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

H2-16KR臺式高速冷凍離心機，湖南可成儀器設備有限公司；FD-1P冷凍干燥機，上海田楓實業有限公司；1260高效液相色譜儀，美國安捷倫公司。

1.3 B.subtilis BJ3-2發酵薏米的工藝流程

B.subtilisBJ3-2發酵薏米工藝流程具體如下：

1.4 B.subtilis BJ3-2發酵薏米的工藝單因素試驗

以川芎嗪含量和溶纖酶酶活為指標，考察發酵方式、料水比(g∶mL)(薏米∶水)=1∶0.8、1∶1、1∶1.2、1∶1.4、1∶1.6)、裝載量(10%、14%、18%、22%和26%)、蒸煮時間(10、20、30、40、50 min)、初始pH(5.5、6、6.5、7、7.5)、接種量(1%、3%、5%、7%、9%)、發酵溫度(28、31、34、37、40 ℃)和發酵時間(48、60、72、84、96 h)等因素對發酵效果的影響。采用控制變量法，其發酵的初始條件為料水比1∶1(g∶mL)、裝載量18%、蒸煮時間20 min、pH 7.0、接種量5%、發酵溫度37 ℃和發酵時間72 h。

1.5 B.subtilis BJ3-2發酵薏米的Box-Behnken優化試驗

在單因素試驗基礎上，確定發酵方式、料水比、裝載量、蒸煮時間、pH、接種量、發酵溫度和發酵時間的取值范圍，采用Box-Behnken試驗設計3因素3水平的響應面分析，以川芎嗪含量和溶纖酶酶活為響應值，得出B.subtilis發酵薏米的最佳發酵工藝。響應面試驗因素與水平設計見表1。B.subtilisBJ3-2發酵黃豆和CICC 20637發酵薏米按B.subtilisBJ3-2發酵糙薏米的優化條件制備。

1.6 分析方法

川芎嗪待測樣液制備：取3.00 g干燥粉末，加入15 mL 80%乙醇溶液，超聲處理30 min，功率500 W，溫度30 ℃；超聲完成后以8 000 r/min離心15 min，取上清液。按以上步驟再提取2次，收集上清液并定容至50 mL，過0.22 μm膜，得供試液。川芎嗪測定采用HPLC測定[6]。

溶纖酶待測樣制備：取25.00 g薏米發酵鮮樣于50 mL滅菌的生理鹽水中浸泡24 h，再以4 000 r/min離心30 min，取上清液待測。溶纖酶酶活采用纖維蛋白平板法測定[11]。

1.7 統計分析

每個樣品至少3次重復數據，實驗結果以平均值±標準差表示，采用SPSS 17.0軟件進行統計方差分析，圖標采用Origin繪制。顯著性水平為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 發酵方式對B.subtilis BJ3-2發酵薏米中川芎嗪產量和溶纖酶酶活的影響

由圖1可知，靜態發酵中川芎嗪產量和溶纖酶酶活顯著高于動態發酵(P<0.05)。靜態發酵中，B.subtilisBJ3-2發酵糙薏米的川芎嗪含量和溶纖酶酶活分別為1.88 mg/g干基(dry weight，DW)和854.37 U/g；B.subtilisBJ3-2發酵精薏米中分別為2.97 mg/g DW和720.84 U/g；B.subtilisBJ3-2發酵碎薏米中分別為0.61 mg/g DW和501.22 U/g。固態發酵具有缺少游離水的流動，供氧足和消耗能量低等優勢；動態發酵具有發酵完全和生產周期短等優點[12]。薏米呈顆粒狀，動態發酵不利于B.subtilisBJ3-2附著在薏米表面，限制其生長繁殖；靜態發酵過程中B.subtilisBJ3-2可深入薏米基料中并穿入基質細胞內，利于B.subtilisBJ3-2生長、繁殖及代謝。吳晶晶[13]也發現紅曲霉發酵固態大米培養基中川芎嗪的含量比液體培養基高3倍。因此，其以靜態發酵方式進行下一步試驗。

A-川芎嗪產量；B-溶纖酶酶活圖1 發酵方式對B.subtilis發酵薏米中川芎嗪產量和溶纖酶酶活的影響Fig.1 Effect of fermentation methods on the tetramethylpyrazine yield and fibrinolytic enzyme activity in B.subtilis-fermented adlay

2.2 料水比、裝載量和蒸煮時間對B.subtilis發酵薏米中川芎嗪產量和溶纖酶酶活的影響

隨著料水比、裝載量和蒸煮時間的增加，薏米中川芎嗪產量和溶纖酶酶活呈先增加后減少的趨勢(圖2)。料水比為1∶1.2(g∶mL)時，B.subtilisBJ3-2發酵糙薏米中川芎嗪產量和溶纖酶酶活都達到最大值；在B.subtilisBJ3-2發酵精薏米中，料水比為1∶1.2(g∶mL)時川芎嗪產量達最大值，但溶纖酶酶活在料水比為1∶1.4(g∶mL)時達最大值；B.subtilisBJ3-2發酵碎薏米中，川芎嗪產量和溶纖酶酶活均在料水比為1∶1.4(g∶mL)時達最大值。裝載量為14%時，B.subtilisBJ3-2發酵糙薏米中川芎嗪產量和溶纖酶酶活達到最大值；B.subtilisBJ3-2發酵精薏米和碎薏米中，裝載量為10%時川芎嗪產量最高，而溶纖酶酶活在裝載量為14%時最高。蒸煮時間為30 min時，B.subtilisBJ3-2發酵糙薏米中川芎嗪產量達最大值，而溶纖酶酶活在蒸煮時間為40 min時達到最大值；B.subtilisBJ3-2發酵精薏米中，川芎嗪產量和溶纖酶酶活均在30 min時達最大值；B.subtilisBJ3-2發酵碎薏米中，川芎嗪產量和溶纖酶酶活均在蒸煮時間為40 min時達到最大值。料水比較低，水分不能滿足菌體生長繁殖所需水分；料水比過高，樣品易發黏結塊致使供氧不足[14]。同時，裝載量過少導致底物被消耗快且水分蒸發快；裝載量過高致使發酵過程中溶氧較少且菌體分布不均勻[15]。此外，蒸煮時間較短，薏米顆粒質地硬且松散；當蒸煮時間過長，薏米易發黏結塊致使溶氧量少[16]。因此，料水比、裝載量和蒸煮時間選擇為1∶1.4(g∶mL)、14%和30 min。

A、D、G-B.subtilis BJ3-2發酵糙薏米；B、E、H-B.subtilis BJ3-2發酵精薏米；C、F、I-B.subtilis BJ3-2發酵碎薏米圖2 料水比、裝載量和蒸煮時間對B.subtilis BJ3-2發酵薏米中川芎嗪產量和溶纖酶酶活的影響Fig.2 Effect of cooking time on the tetramethylpyrazine yield and fibrinolytic enzyme activity in B.subtilis BJ3-2-fermented adlay注：圖中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.3 初始pH對B.subtilis BJ3-2發酵薏米中川芎嗪產量和溶纖酶酶活的影響

隨著初始pH的增加，川芎嗪產量和溶纖酶酶活先增加后減少(圖3)。初始pH值為7.0時，B.subtilisBJ3-2發酵糙薏米和精薏米中川芎嗪產量和溶纖酶酶活達最大值。B.subtilisBJ3-2發酵碎薏米中，川芎嗪產量在初始pH值為7時達到最大值，但溶纖酶酶活卻在pH值為6.5時達最大值。弱酸環境有利于B.subtilisBJ3-2生長繁殖及代謝合成乙偶姻(川芎嗪的前體物)，但過酸的環境條件下，菌株生長緩慢，延遲期較長[17]。ZHU等[18]利用兩階段pH值控制培養法來獲取高產量川芎嗪，即發酵48 h前pH值控制為5.5、48 h后pH值調控為7.0，獲得7.43 g/L的川芎嗪。但納豆激酶最適pH值為8.0，而堿性條件下川芎嗪不穩定[19]。因此，pH 7.0是B.subtilisBJ3-2生長繁殖并同時獲得較高水平的川芎嗪和溶纖酶的保證。

2.4 接種量、發酵溫度和發酵時間對B.subtilis BJ3-2發酵薏米中川芎嗪產量和溶纖酶酶活的影響

隨著接種量、發酵時間和發酵溫度的增加，川芎嗪產量和溶纖酶酶活先增加后減少(圖4)。接種量為9%時，B.subtilisBJ3-2發酵糙薏米和碎薏米中川芎嗪產量和溶纖酶酶活達最大值；在B.subtilisBJ3-2發酵精薏米中，川芎嗪產量在接種量為9%時達到最大值，而溶纖酶酶活在接種量為7%時達到最大值。發酵溫度為37 ℃時，B.subtilisBJ3-2發酵糙薏米中川芎嗪產量和溶纖酶酶活達最大值。B.subtilisBJ3-2發酵精薏米和碎薏米中，川芎嗪產量在發酵溫度為37 ℃時為最大值，但溶纖酶酶活在40 ℃時為最大值。川芎嗪產量在發酵時間為96 h時為最大值；而發酵時間為84 h時，B.subtilisBJ3-2發酵糙薏米、精薏米和碎薏米中溶纖酶酶活達最大值。接種量較少，致使菌體發酵周期延長及菌體活力低誘導次級代謝產物產生的酶少；接種量過大，菌體生長旺盛并較快達穩定期，后迅速老化自溶，次級產物生成的時間短[20]。朱兵峰[21]建立了多階段轉速偶聯溫度控制發酵策略：0～48 h時，控制培養溫度37 ℃；48～120 h，控制培養溫度55 ℃，川芎嗪的產量達7.12 g/L。

A-B.subtilis BJ3-2發酵糙薏米；B-B.subtilis BJ3-2發酵精薏米；C-B.subtilis BJ3-2發酵碎薏米圖3 初始pH值對B.subtilis BJ3-2發酵薏米中川芎嗪產量和溶纖酶酶活的影響Fig.3 Effect of initial pH on the tetramethylpyrazine yield and fibrinolytic enzyme activity in B.subtilis BJ3-2-fermented adlay

A、D、G-B.subtilis BJ3-2發酵糙薏米；B、E、H-B.subtilis BJ3-2發酵精薏米；C、F、I-B.subtilis BJ3-2發酵碎薏米圖4 接種量、發酵溫度和發酵時間對B.subtilis BJ3-2發酵薏米中川芎嗪產量和溶纖酶酶活的影響Fig.4 Effect of fermentation time on the tetramethylpyrazine and fibrinolytic enzyme activity in B.subtilis BJ3-2-fermented adlay

2.5 B.subtilis BJ3-2發酵薏米的Box-Behnken優化結果

為確定B.subtilisBJ3-2發酵薏米最佳發酵條件，選擇接種量、發酵溫度和發酵時間3個因素，以川芎嗪產量和溶纖酶酶活為評價指標進行響應面分析，Box-Behnken優化試驗結果如表1所示。如表2～表4所示，在B.subtilisBJ3-2發酵糙薏米、精薏米和碎薏米中，回歸模型極顯著(P<0.01)，失項擬合不顯著(P>0.05)，說明該回歸模型擬合度良好，實驗誤差小。

表1 B.subtilis BJ3-2發酵糙薏米產川芎嗪和溶纖酶的Box-Behnken優化結果Table 1 Box-Behnken design matrix of experimental values of the tetramethylpyrazine yield and fibrinolytic enzyme activity in B.subtilis BJ3-2-fermented adlay

為了驗證模型預測，并分析川芎嗪產量和纖溶酶酶活的發酵基質(薏米和黃豆)及菌株(B.subtilisBJ3-2和CICC 20637)依懶性。經驗證(圖5)，B.subtilisBJ3-2發酵糙薏米中川芎嗪產量為6.15 mg/g DW，纖溶酶酶活為2 236.47 U/g，比未優化的發酵糙薏米分別增加了3.27和2.64倍；B.subtilisBJ3-2發酵精薏米中川芎嗪產量為6.93 mg/g DW，纖溶酶酶活為2 097.26 U/g，比未優化的發酵糙薏米分別增加了2.34和2.97倍；B.subtilisBJ3-2發酵碎薏米中川芎嗪產量為5.09 mg/g DW，纖溶酶酶活為2 011.56 U/g，比未優化的發酵糙薏米分別增加了8.48和4.01倍。而在B.subtilisBJ3-2發酵黃豆中，溶纖酶酶活(2 674.68 U/g)高于B.subtilisBJ3-2發酵薏米，但川芎嗪產量(0.05 mg/g DW)遠低于B.subtilisBJ3-2發酵薏米。在B.subtilisCICC 20637發酵薏米中，川芎嗪產量和溶纖酶酶活均低于B.subtilisBJ3-2發酵薏米。而原料加工過程中，糙薏米通過精碾去皮拋光才獲得精薏米，同時產生占總質量5%～10%的碎薏米和5%的薏米糠[21]，因此，綜合考慮加工成本，糙薏米可作為發酵高產川芎嗪和溶纖酶的最佳原料。

表2 B.subtilis BJ3-2發酵糙薏米的回歸模型方差分析Table 2 Regression analysis of variance in B.subtilis BJ3-2 fermented dehulled adlay

圖5 不同發酵基質和發酵菌株中川芎嗪產量和溶纖酶酶活結果Fig.5 Results of the tetramethylpyrazine yield and fibrinolytic enzyme activity in different substrate-and bacterial strain-fermentation注：BDA-B.subtilis BJ3-2發酵糙薏米；BPA-B.subtilis BJ3-2發酵精薏米；BBA-B.subtilis BJ3-2發酵碎薏米；BSB-B.subtilis BJ3-2發酵黃豆；CDA-B.subtilis CICC 20637發酵糙薏米；CPA-B.subtilis CICC 20637發酵精薏米；CBA-B.subtilis CICC 20637發酵碎薏米

川芎嗪是中藥川芎的主要生物活性成分，但川芎嗪含量較低(平均含量2.19 μg/g)。在其他發酵產品如醋、白酒和豆豉中，川芎嗪含量分別為0.001～0.131 mg/g[22]、88.70～1 417.59 μg/L[23]和0.511 μg/g[24]，其含量均低于B.subtilisBJ3-2發酵薏米中川芎嗪含量。利用微生物高效合成川芎嗪主要集中于篩選優良菌株、添加前體物質、優化培養條件或改造細胞工程等[25]，但目前專注于轉換培養基基料的相關研究較少。XIAO等[26]研究發現，添加30.1 g/L的乙偶姻和67.7 g/L的磷酸二銨，可得到8.34 g/L的川芎嗪，這是目前研究中的川芎嗪最高產量。本研究以單一薏米為發酵基料，構建了B.subtilisBJ3-2發酵薏米高產川芎嗪的優化模型，其含量分別為B.subtilisBJ3-2發酵黃豆和CICC 20637發酵糙薏米的204和12倍，表明B.subtilisBJ3-2發酵薏米是一種高產川芎嗪的新方法。

表3 B.subtilis BJ3-2發酵精薏米的回歸模型方差分析Table 3 Regression analysis of variance in B.subtilis BJ3-2fermented polished adlay

表4 B.subtilis BJ3-2發酵碎薏米的回歸模型方差分析Table 4 Regression analysis of variance in B.subtilis BJ3-2 fermented broken adlay

3 結論

通過單因素和Box-Behnken試驗分析，接種量為9.0%、發酵溫度為40 ℃和發酵時間為93 h時，B.subtilisBJ3-2發酵糙薏米中川芎嗪產量和溶纖酶酶活分別為6.15 mg/g DW和2 236.47 U/g，接種量為8.1%、發酵溫度為38 ℃和發酵時間為96 h時，發酵精薏米中川芎嗪產量和溶纖酶酶活分別為6.94 mg/g DW和2 142.18 U/g，但碎薏米中川芎嗪產量和溶纖酶酶活均明顯偏低。綜合考慮加工成本，B.subtilisBJ3-2發酵糙薏米可作為高產川芎嗪產量和溶纖酶的最佳發酵體系。擬在B.subtilisBJ3-2發酵薏米高產川芎嗪工藝優化基礎上，將對發酵過程中川芎嗪合成的關鍵酶及前體物進行關聯剖析，并采用轉錄組學和蛋白組學技術揭示其高產川芎嗪機理等相關研究，為延長薏米加工產業鏈和開發高值化新產品提供科學依據。