球毛殼菌CGMCC 6882利用小麥秸稈發酵生產抗氧化多糖

王子朝，郭佳源，郜文碩，崔靜雯，楊青青，朱金帆，張慧茹

1(河南工業大學 生物工程學院，河南 鄭州，450001)2(河南工業大學 國際教育學院，河南 鄭州，450001)

我國是小麥種植與消費大國，小麥秸稈作為小麥種植的副產物，年產量高達15 334萬t。但小麥秸稈分布零散、體積大、運輸成本高以及綜合利用經濟性差、產業化程度低等缺點，導致大量小麥秸稈未被有效利用，不僅造成資源浪費，還帶來很多安全隱患和環境污染[1]。小麥秸稈的主要成分為纖維素、半纖維素和木質素，是一種產量巨大的木質纖維素資源[2]。由于木質素和半纖維素之間以牢固的醚鍵或酯鍵相互交聯并鑲嵌在纖維素內，且木質素包裹在纖維素外形成一種外圍基質，使得木質纖維素產品的直接利用變得異常困難，限制了小麥秸稈的利用[3]。因此，有效開發利用小麥秸稈資源已成為提高麥田經濟效益和綠色可持續發展的途徑之一。

本實驗以小麥秸稈為唯一碳源接種球毛殼菌CGMCC 6882進行發酵，并對發酵產生的胞外多糖進行提取純化、結構解析和抗氧化活性分析，探究球毛殼菌CGMCC 6882對小麥秸稈的利用情況。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

小麥秸稈，河南鄭州郊區；單糖標準品，美國Sigma公司；瓊脂、蛋白胨、三氟乙酸、苯酚、濃硫酸，國藥集團化學試劑有限公司；胰酶消化液、青霉素、鏈霉素、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)檢測試劑盒，上海碧云天生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

HD500MHZ核磁共振儀，德國Bruker公司；Waters 1525高效液相排阻色譜儀，美國Waters公司；HT7700透射電子顯微鏡，日本HITACHI公司；WQF-510紅外光譜儀，天津天光光學儀器有限公司；Q50 熱重分析儀，美國TA公司；Series 8000 WJCO2細胞培養箱，美國Thermo Fisher公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 球毛殼菌CGMCC 6882利用小麥秸稈發酵生產活性多糖

1.3.1.1 球毛殼菌CGMCC 6882菌種活化

采用馬鈴薯、葡萄糖和瓊脂制備PDA培養基，然后將冰箱中保藏的球毛殼菌CGMCC 6882取出并接種于PDA平板上，置于28 ℃生化培養箱中培養3 d左右。

1.3.1.2 球毛殼菌CGMCC 6882利用小麥秸稈發酵

將小麥秸稈烘干、粉碎、過60目篩，并以其作為唯一碳源配制發酵培養基，按2%接種量接種球毛殼菌CGMCC 6882種子液，28 ℃、150 r/min培養7 d。

1.3.1.3 發酵液的收集與處理

發酵結束后，發酵液抽濾除菌體和大顆粒不溶性雜質，25 ℃、10 000 r/min離心20 min除去不溶性細小顆粒，收集上清液并在60 ℃、0.1 MPa下旋蒸濃縮。濃縮液中加入活性炭于25 ℃、150 r/min振蕩過夜并離心取上清液。上清液中加入3倍體積Sevage溶劑脫蛋白，然后加入4倍體積無水乙醇4 ℃過夜析出多糖。最后，將多糖凍干并研磨收集。

1.3.1.4 發酵過程中多糖含量的測定

以不接種球毛殼菌CGMCC 6882的發酵培養基作空白對照，分別在不同時間用吸管吸取2 mL空白對照組和實驗組發酵液。加5倍無水乙醇析出多糖沉淀，再加蒸餾水復溶，并定容到50 mL。然后采用苯酚-硫酸法測定樣品中多糖含量[4]。

1.3.2 多糖結構特征分析

采用高效體積排阻色譜測定多糖分子質量，色譜條件為：UltrahydrogelTMLinear 300 mm×7.8 mm二級串聯柱，流動相0.1 mol/L硝酸鈉，流速0.9 mol/min，柱溫45 ℃。用Mw(重均分子質量) 分別為270 000、975 000、3 680 000、13 535 000 Da的葡聚糖標品繪制分子質量校正曲線。

使用高效離子色譜測定單糖組成，色譜條件：Dionex CarboPacPA20 (3 mm×150 mm) 陰離子交換柱，Dionex CarboPacPA20 (3 mm×50 mm) 保護柱，以18 mmol/L NaOH溶液為流動相，等度洗脫，流速0.5 mL/min，柱溫30 ℃，脈沖安培檢測器檢測，進樣體積為20 μL。

稱取1.0 mg球毛殼菌CGMCC 6882胞外多糖，然后與200 mg溴化鉀充分研磨并壓片，采用紅外光譜儀于400～4 000 cm-1對樣品進行紅外掃描，并用OMNIC 8.2軟件處理紅外數據。

稱取球毛殼菌CGMCC 6882胞外多糖約3 mg，以1 mL重水溶液進行溶解，放置室溫下過夜使多糖完全溶解，渦旋混勻，以7 200 r/min離心10 min，最后將樣品轉移到5 mm核磁管中進行檢測。核磁檢測條件如下：PA BBI 400S1 H-BB-D-05 Z探頭，共振頻率500 MHz，儀器檢測溫度298 K。以四甲基硅烷(δ= 0 ppm)和重水(D2O)(δ= 4.8 ppm) 作化學位移內標。

稱取球毛殼菌CGMCC 6882胞外多糖1 mg加入到100 mL水中，室溫下150 r/min磁力攪拌過夜，然后將多糖溶液滴到銅網上，晾干后采用透射電子顯微鏡進行掃描觀察，根據觀察要求放大不同倍數。

稱取3 mg左右球毛殼菌CGMCC 6882胞外多糖，使用Al2O3作參比物，在0.15 MPa的N2氣氛下從35 ℃升溫至300 ℃進行熱重分析，升溫速率10 ℃/min。

1.3.3 多糖的體外抗氧化活性

球毛殼菌CGMCC 6882胞外多糖清除ABTS陽離子自由基、超氧陰離子、羥自由基和DPPH自由基的活性參照HU等[5]方法進行檢測。

1.3.4 多糖的細胞抗氧化活性

1.3.4.1 細胞氧化損傷誘導模型的構建

將Caco-2細胞活化接種于96孔板，移入細胞培養箱中培養24 h。之后每孔加入100 μL含不同H2O2濃度的細胞培養液，對Caco-2細胞進行誘導損傷。采用MTT染色法在490 nm處測定各組吸光值。

1.3.4.2 球毛殼菌CGMCC 6882胞外多糖的細胞抗氧化活性

細胞損傷會導致其清除H2O2能力下降，引起脂質過氧化反應，過氧化物MDA 大量聚集。SOD、CAT和GSH-Px是抗氧化酶系的重要組成部分，通過測定加入不同濃度多糖溶液的細胞氧化誘導Caco-2細胞損傷模型胞內SOD、CAT、GSH-Px和MDA活力變化，分析球毛殼菌CGMCC 6882胞外多糖對細胞的氧化保護作用[6]。

將接種了Caco-2細胞的96孔細胞培養板移入細胞培養箱中，培養至細胞狀態穩定。然后，多糖試驗組每孔加入100 μL含IC50左右值濃度的H2O2和不同濃度CGMCC 6882胞外多糖的培養液。試驗設置空白組 (不加H2O2和CGMCC 6882胞外多糖) 和H2O2對照組 (不加CGMCC 6882胞外多糖，只加培養液和400 μmol/L的H2O2溶液)。最后，將上述5組細胞均置于細胞培養箱中，在37 ℃和含5%(體積分數)CO2條件下培養4 h。之后每孔加入100 μL細胞裂解液使細胞裂解，然后于4 ℃下8 000 r/min離心10 min，取上清液作為樣本，參照試劑盒說明書對Caco-2胞內的SOD、CAT、GSH-Px和MDA活力進行測定。

2 結果與分析

2.1 球毛殼菌 CGMCC 6882利用小麥秸稈發酵生產活性多糖

以小麥秸稈為唯一碳源配制平板培養基，并接種球毛殼菌CGMCC 6882，發現平板上長出白色菌落 (圖1-a)，證明其具有降解利用小麥秸稈的能力。將球毛殼菌CGMCC 6882接種至發酵培養基進行發酵，對其發酵液進行抽濾除菌、離心、濃縮、脫色、脫蛋白、醇沉、柱層析和冷凍干燥等處理獲得胞外多糖(圖1-b)。對發酵過程中多糖產量進行監測(圖1-c)，空白對照組在培養過程中幾乎沒有多糖產生，說明發酵液中多糖是由球毛殼菌CGMCC 6882所產生。同時，XIANG等[7]發現Inonotusobliquus可以利用玉米秸稈生產抗氧化性多糖；XU等[8]也證實I.obliquus可以分別利用小麥秸稈、水稻秸稈和甘蔗渣發酵生產抗氧化活性胞外多糖。

a-球毛殼菌CGMCC 6882生長情況;b-球毛殼菌CGMCC 6882胞外多糖；c-發酵液中多糖含量圖1 球毛殼菌CGMCC 6882在小麥秸稈平板上生長情況、胞外多糖生成情況及發酵液中多糖產量Fig.1 Growth profile of C.globosum CGMCC 6882 on wheat straw plate, polysaccharide produced, the content of polysaccharide in fermentation broth

2.2 多糖結構特征解析

球毛殼菌CGMCC 6882胞外多糖的單糖組成為鼠李糖、氨基葡萄糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、果糖和葡萄糖醛酸，且其摩爾比為21.46∶1.58∶1.11∶55.15∶36.37∶7.04∶7.34 (圖2-a)。同時，高效液相排阻色譜檢測結果顯示(圖2-b)，球毛殼菌CGMCC 6882胞外多糖的Mn(數均分子質量)為3.391×104Da，Mw為3.538×104Da，分散系數為1.043。LIU等[9]研究發現，單糖組成中葡萄糖酸和海藻糖含量影響Pleurotuscitrinipileatus多糖的抗氧化活性。SONG等[10]發現糖苷鍵類型和巖藻糖含量能夠影響平菇多糖的抗氧化活性。但LI等[11]證實，木糖含量對EpimediumkoreanumNakai多糖的抗氧化活性影響不大。大量研究發現，多糖的分子質量與其活性之間存在密切聯系[12]。BLASCHEK等[13]發現分子質量可以影響多糖的生物活性，高分子質量葡聚糖具有較好免疫調節活性。ZHANG等[14]發現Pleurotustuber-regium多糖分子質量影響其抗腫瘤活性。WANG等[15]研究也證實，小分子質量多糖具有更好的抗癌活性。單糖組成及比例和分子質量大小會影響多糖及寡糖的生物活性，可使多糖具有不同生物活性。

a-離子色譜；b-排阻色譜圖2 球毛殼菌CGMCC 6882胞外多糖色譜圖Fig.2 Chromatography of exopolysaccharide from C.globosum CGMCC 6882

CGMCC 6882胞外多糖在水溶液中形成米粒狀小顆粒，而非網狀或交聯狀，說明這一胞外多糖的分子質量可能較小。SHEN等[18]在研究Nostocflagelliforme多糖的理化特性和抗氧化活性時發現，多糖的空間結構也會影響其生物活性，尤其是抗氧化活性。熱重分析結果顯示(圖4)，CGMCC 6882胞外多糖在整個加熱過程中有2個降解階段，第1個降解階段出現在100 ℃左右，主要是由于多糖結合水受熱揮發導致質量減少，第2個降解階段開始于200 ℃左右，主要是由于多糖主鏈及氫鍵斷裂，生成CO2和水導致的失重降解[19]。

圖4 球毛殼菌CGMCC 6882胞外多糖的熱重分析結果Fig.4 Thermogravimetric analysis results of polysaccharide produced by C. globosum CGMCC 6882

2.3 多糖的體外抗氧化活性

球毛殼菌CGMCC 6882胞外多糖可以有效清除DPPH自由基、羥自由基、超氧陰離子和ABTS陽離子自由基，且清除率與多糖濃度成正相關 (圖5)。當多糖質量濃度為5 mg/mL時，對上述自由基的清除率分別為(83.08±2.58)%、(81.39±1.47)%、(79.38±2.03)%和(85.69±1.62)%。大量實驗證明自由基會干擾機體正常的新陳代謝，引起DNA、蛋白質、脂類等生物大分子的氧化損傷，進而誘發心血管疾病、糖尿病等多種疾病[20]。王浩南等[21]發現丹參花多糖不僅具有較強抗氧化活性，同時還具有保護神經細胞、抑制黑色素生成和保肝等作用。球毛殼菌CGMCC 6882胞外多糖可以有效清除體內自由基，有延緩衰老和保護機體的作用，有望在食品和醫藥等領域得到應用。

a-DPPH自由基;b-羥自由基;c-超氧陰離子;d-ABTS陽離子自由基圖5 球毛殼菌CGMCC 6882胞外多糖的抗氧化能力Fig.5 Antioxidant capacity of polysaccharide produced by C.globosum CGMCC 6882

2.4 多糖的細胞抗氧化

當H2O2濃度增加到400 μmol/L時，細胞活性下降到(51.2±1.5)%，適于構建細胞氧化損傷模型 (圖6)。因此，選擇400 μmol/L的H2O2誘導構建Caco-2細胞氧化損傷模型。細胞抗氧化模型分析發現(圖7)，H2O2組MDA活力顯著升高，SOD、CAT和GSH-Px活力均顯著下降，說明H2O2對Caco-2細胞造成了氧化損傷。多糖實驗組中MDA酶活水平從(15.8±0.25) μmol/g降低至(7.5±0.31) μmol/g，且MDA酶活水平與球毛殼菌CGMCC 6882胞外多糖濃度成負相關。同時，多糖實驗組細胞內的SOD、CAT和GSH-Px活力水平明顯升高，分別從(147.28±4.82)、(11±1.15)和(18.08±1.96) U/mg增加至(238.89±3.91)、(39.12±0.76)和(41.35±2.18) U/mg，且與球毛殼菌CGMCC 6882胞外多糖濃度成正相關。上述結果表明，球毛殼菌CGMCC 6882胞外多糖對被H2O2氧化損傷的Caco-2細胞有很好的保護作用[22]。同時，吳麗紅等[23]研究發現，川牛膝多糖對H2O2誘導的PC12細胞氧化損傷具有一定保護作用；顧程遠等[24]研究也證實，桔梗多糖對H2O2誘導的PC12細胞氧化損傷也有一定保護作用。這些實驗中的多糖與本實驗所獲得的球毛殼菌CGMCC 6882胞外多糖具有相似的抗氧化作用。

圖6 不同濃度H2O2對細胞存活率的影響Fig.6 Effect of different concentrations H2O2 on the cell viability of Caco-2 cells

圖7 球毛殼菌CGMCC 6882胞外多糖對Caco-2胞內SOD、CAT、GSH-Px和MDA活力的影響Fig.7 Effect of polysaccharide produced by C.globosum CGMCC 6882 on the SOD, CAT, GSH-Px, and MDA activities in Caco-2 cells

3 結論

小麥秸稈的隨意丟棄和堆放，不僅造成資源浪費，還帶來很多安全隱患和環境污染等問題。本實驗以小麥秸稈為唯一碳源，采用球毛殼菌CGMCC 6882進行發酵獲得了一種具有良好抗氧化性的胞外多糖。在未來的研究中，我們將采用代謝途徑分子改造、小麥秸稈預處理和發酵工藝優化等策略，實現球毛殼菌CGMCC 6882利用小麥秸稈工業化生產活性胞外多糖。