基于染料Genefinder的熒光傳感體系檢測玉米赤霉烯酮

郭婷，陳金航，周鴻媛，張宇昊，馬良

(西南大學 食品科學學院，重慶，400715)

玉米赤霉烯酮(zearalenone, ZEN)是由鐮刀菌屬真菌產生的一種毒素[1]，廣泛存在于玉米、小麥、大米等谷物、飼料和動物制品中。ZEN具有類雌激素作用，進而影響人體和動物的生殖系統[2-3]。此外，ZEN還具有免疫毒性、肝腎毒性及致癌性[4-5]。我國國標規定小麥及玉米中ZEN含量不超過60 μg /kg，飼料中ZEN含量不超過500 μg/kg。目前，食品中ZEN的檢測方法有高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)[6-10]、免疫法[11-14]、生物傳感器法[15-18]等。高效液相色譜法準確度和穩定性較高，但需要復雜的樣品前處理及昂貴的儀器設備，不能滿足食品安全快速檢測的要求。免疫分析法具有高效、快速的特點，但其會出現假陽性問題，并且抗體的制備周期較長、穩定性差，限制了該方法的應用。

適配體是一種單鏈DNA或RNA，通過指數富集(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)系統篩選產生，能夠與靶標進行特異性結合，穩定且易制備，在4 ℃條件下能保存半年甚至更久，不會影響其結構[19-21]，目前已廣泛應用于食品安全檢測及疾病診斷方面。HE等[22]利用適配體的特異性構建基于內濾效應的熒光比率分析法檢測ZEN和伏馬毒素，該方法選擇性高，實際樣品加標回收率在89.9%～106.6%。ZHANG等[23]通過SELEX法篩選出ZEN適配體，并建立基于納米金的無標記可視化方法檢測ZEN。HE等[24]構建基于納米材料和適配體的高靈敏的電化學傳感方法成功用于ZEN檢測，其中納米材料(CoSe2/AuNRs和DNA-PtNi@Co-MOF)的主要作用是放大檢測信號，該方法的檢出限為1.37 fg/mL。另有新型3D櫻花狀金屬有機框架材料也可用于電化學信號放大，該方法檢出限可達0.45 fg/mL[25]。本課題組也開發了多種適配體熒光傳感器檢測黃曲霉毒素、展青霉毒素等真菌毒素[26-28]。

Genefinder染料是一種新型花青素類核酸染料，與雙鏈DNA作用后熒光會增強800～1 000倍，毒性低、靈敏度高[29-30]，可以有效保護實驗人員和環境，常用于電泳中核酸染色[30-31]，在檢測方面的研究較少。因此，本研究利用核酸適配體的特異性，結合熒光染料Genefinder特殊的熒光特性構建熒光傳感體系，用于簡單、高靈敏、快速檢測ZEN。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

UV-2450紫外分光光度計,日本島津公司；F-2500熒光分光光度計,日本日立公司；臺式高速離心機,德國Eppendorf公司。

ZEN適配體(5′-TCATCTATCTATGGTACATTACTATCTGTAATGTGATATG-3′)[32]，互補鏈(5′- TCAAATTAAAGATAATAATGTATTATAGAT-3′)，生工生物工程(上海)有限公司；染料Genefinder，合肥博美生物科技有限責任公司；ZEN、黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)、黃曲霉毒素G1(aflatoxin G1，AFG1)、赭曲霉毒素A(ochratoxin A，OTA)、單端孢霉烯(T-2)毒素標準品，美國Sigma公司；玉米粉購于本地超市。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA濃度測定

DNA濃度以單鏈濃度表示，利用紫外-可見分光光度計測定DNA在260 nm處的吸光度，依據朗伯比爾定律(A=εbc)計算得DNA的濃度，于-20 ℃備用。

1.2.2 熒光傳感器對ZEN的檢測

DNA備用溶液解凍后，水浴90 ℃處理10 min，逐漸冷卻至室溫備用。將ZEN適配體與等體積等濃度互補鏈混合，再加入一定濃度ZEN孵育一段時間后，加入2 μL Genefinder100×，測定熒光光譜(激發波長500 nm)。

1.2.3 實際樣品中ZEN的檢測

向玉米粉樣品中加入一定量ZEN，分別配成質量濃度為5、20 μg/L的陽性樣本。用90%(體積分數)乙腈水溶液超聲提取30 min，離心后取上清液，氮吹吹干后加入緩沖溶液，按照構建的熒光傳感體系檢測ZEN。

2 結果與分析

2.1 檢測原理

本研究利用Genefinder的特性構建熒光傳感體系用于快速檢測ZEN。檢測原理圖如圖1-A，ZEN適配體與其互補鏈形成雙鏈結構，Genefinder染料與雙鏈結構DNA作用后產生較強的熒光，當加入毒素ZEN后，適配體優先識別ZEN，雙鏈打開，Genefinder染料熒光猝滅。首先研究方法的可行性，以500 nm作為激發波長，觀察不同條件下體系熒光信號的變化情況。圖1-B顯示單鏈適配體(a)及互補鏈(b)與Genefinder作用后顯示出較微弱的熒光信號。ZEN適配體與其互補鏈形成雙鏈結構，Genefinder染料與雙鏈結構DNA結合后熒光信號明顯增強(d)，加入毒素ZEN后，適配體與ZEN結合，雙鏈打開，Genefinder染料熒光強度降低(e)。根據熒光強度的改變檢測目標物ZEN的含量。

a-ZEN適配體+Genefinder;b-互補鏈+Genefinder;c-40 μg/L ZEN;d-ZEN適配體+互補鏈+Genefinder;e-ZEN適配體+互補鏈+40 μg/L ZEN+GenefinderA-傳感體系的檢測原理圖;B-不同條件下熒光光譜圖1 傳感體系原理圖及可行性分析Fig.1 Schematic of sensing system and feasibility

2.2 檢測條件優化

2.2.1 孵育時間

實驗中適配體需要與目標物孵育一段時間才能更好地識別目標物。因此本試驗研究孵育時間對熒光信號的影響。如圖2所示，隨著孵育時間的延長，熒光猝滅量逐漸增強，當孵育時間60 min時，熒光猝滅量達到最大，說明體系中ZEN適配體與ZEN結合已達到飽和。因此，本實驗選擇60 min為最佳孵育時間。

圖2 孵育時間對熒光強度的影響Fig.2 Effect of incubated time on the fluorescence注：F0和F分別表示沒有目標物和添加目標物時的熒光強度(下同)

2.2.2 適配體用量

適配體用量會影響熒光傳感體系的靈敏度。圖3顯示適配體濃度對熒光傳感體系的影響。結果表明，隨著ZEN適配體用量的增加，熒光猝滅程度迅速增加，當適配體濃度達到100 nmol/L時，熒光猝滅量趨于穩定。因此，適配體用量選擇100 nmol/L作為后續實驗用量。

圖3 適配體用量對熒光強度的影響Fig.3 Effect of aptamer on the fluorescence

2.3 熒光傳感體系的構建

在上述最佳的實驗條件下，以ZEN為目標物構建熒光傳感體系。結果如圖4-A所示，隨著ZEN濃度的增加，傳感體系熒光強度逐漸減弱，這是由于ZEN的加入破壞了雙鏈結構，從而造成熒光減弱。然而當ZEN濃度達到一定值時，熒光強度不再明顯降低，達到平衡。從圖4-B可以看出，1-F/F0與ZEN濃度的對數在0.1～200 μg/L呈線性關系，實際可檢測的檢出限為0.1 μg/L。結果表明該熒光傳感體系具有較高的靈敏度。

a-0 μg/L;b-0.1 μg/L;c-0.5 μg/L;d-1 μg/L;e-5 μg/L;f-10 μg/L;g-50 μg/L;h-100 μg/L;i-200 μg/L;j-500 μg/LA-不同濃度ZEN對所構建傳感體系熒光響應變化；B-1-F/F0與ZEN濃度對數的線性關系圖4 傳感體系對ZEN的熒光響應Fig.4 Fluorescence resptnse of sensor with ZEN

2.4 熒光傳感體系選擇性

為了考察熒光傳感體系的選擇性，本研究以黃曲霉毒素B1(AFB1)、黃曲霉毒素G1(AFG1)、赭曲霉毒素A(OTA)、單端孢霉烯毒素(T-2)為對照毒素研究該傳感體系的特異性，結果如圖5所示。加入40 μg/L ZEN時，熒光傳感體系的熒光強度猝滅量顯著增加，而加入同濃度的對照毒素并未造成熒光體系明顯的熒光猝滅，這是因為傳感體系中使用的適配體與ZEN可以特異性結合，而與其他毒素無明顯作用。結果表明該傳感體系對ZEN具有較好的選擇性。

圖5 方法選擇性Fig.5 Selectively of sensing system注：ZEN質量濃度為40 μg/L，其他對照毒素質量濃度均為40 μg/L

2.5 實際樣品測定

為了考察傳感體系實際測定效果，以玉米粉作為實際陰性樣品，研究加標回收情況。結果如表1所示，利用傳感體系檢測的加標回收率在100.4%～105.8%，這說明該熒光傳感體系可用于真實復雜樣品中ZEN的測定。

表1 實際樣品加標回收率(n=3)Table 1 Real sample spike recovery (n=3)

3 結論

本研究構建了一種基于Genefinder和適配體的熒光傳感體系檢測ZEN，在最優條件下，傳感體系的線性范圍為0.1～200 μg/L，實際檢出限為0.1 μg/L，并成功用于出玉米粉中ZEN的測定，加標回收率在100.4%～105.8%。本方法為開發簡單、快速、靈敏的生物傳感體系開辟了新的途經。