基于氣相色譜-離子遷移譜對不同產地羊肚菌風味化合物的分析

楊芳，范成夢，賈洪鋒*，任芳

1(四川旅游學院 食品學院，四川 成都，610100)2(山東海能科學儀器有限公司，山東 德州，251500)

羊肚菌(Morchellaspp.)俗稱羊肚菜，為馬鞍菌科屬珍稀的食藥兩用真菌[1]。羊肚菌含有優質蛋白質、多糖、多酚、鐵、鉀、磷、硒等營養元素，羊肚菌風味獨特、味道鮮美、肉質脆嫩可口，營養豐富[2-3]。已有研究表明，羊肚菌或其提取物具有降血脂、抗腫瘤、抗氧化等生物活性[4-7]。目前，對羊肚菌的研究主要集中在人工種植栽培條件的篩選[8]、多糖的提取及純化[9-10]、發酵產物功能性研究[11]及硒化修飾[12]等方面。

氣相色譜-離子遷移譜(gas chromatography-ion mobility spectrum，GC-IMS)是近年來出現的一種新型氣相分離和檢測技術，該項技術整合了GC、IMS在分離和檢測方面的優勢，形成具有高靈敏度、高分辨率、操作簡便、分析高效等特點的方法，特別適合于部分揮發性有機化合物的痕量檢測。目前，國內外將GC-IMS用于食品檢測分析的研究日益增多[13]，如應用于菌類及菌湯風味成分分析[14-15]、植物油鑒別及摻假檢測[16]、酒類發酵過程中風味的變化[17]、蛋類新鮮度鑒別[18]、調味品風味物質的檢測分析[19]、果蔬在貯藏過程中風味化合物的分析檢測[20]等。

目前，利用GC-IMS檢測技術對羊肚菌風味成分進行分析的報道較少。本文以長白山、林芝、青川、香格里拉4個產地羊肚菌為研究對象，在研究其蛋白質、粗多糖及總酚含量的基礎上，利用氨基酸自動分析儀檢測樣品的游離氨基酸種類及含量，進而再利用GC-IMS檢測樣品的揮發性有機物(volatile organic compounds，VOCs)。通過主成分分析(principal component analysis，PCA)、熱圖聚類分析對VOCs進行化學計量學分析，對比分析了不同產地羊肚菌的營養和風味成分的差異，為羊肚菌資源的開發利用提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羊肚菌：吉林長白山、西藏林芝、四川青川、云南香格里拉羊肚菌原料產地。

沒食子酸、80%(體積分數)乙醇、碳酸鈉、硫酸銅、硫酸鉀、硫酸、氫氧化鈉、對硝基苯酚、乙酸鈉、乙酸、37%甲醛、乙酰丙酮、無水乙醇、苯酚、葡萄糖，成都市科隆化學品有限公司；福林酚，上海康朗生物科技有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

L-8800型日立全自動氨基酸分析儀，日本日立公司；FlavorSpec?食品風味分析儀(含CTC自動頂空進樣器、Laboratory Analytical Viewer(LAV)分析軟件、GC×IMS Library Search 軟件及軟件內置的NIST數據庫和IMS數據庫對物質進行定性分析)，德國G.A.S公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品準備

分別將各羊肚菌樣品清潔干凈，取菌蓋干品粉碎成菌粉后，密封，編號(長白山產羊肚菌樣品標記為CBS；林芝產樣品標記為LZ；青川產樣品標記為QC；香格里拉產樣品標記為XGLL)，待測。

1.3.2 理化指標檢測

蛋白質含量的測定：分光光度法，參照GB 5009.5—2016《食品中蛋白質的測定》，平行測定3次。

粗多糖含量的測定：參照NY/T 1676—2008《食用菌中粗多糖含量的測定》，平行測定3次。

總酚含量的測定：根據參考文獻[21]所述方法進行測定，平行測定3次。

1.3.3 游離氨基酸含量測定

參照GB/T 5009.124—2016《食品中氨基酸的測定》進行測定。平行測定2次。

1.3.4 VOCs的測定

取1 g羊肚菌樣品于20 ml頂空進樣瓶中，80 ℃孵化20 min，經頂空進樣用氣相離子遷移譜儀FlavorSpec?進行測試。平行測定3次，各樣品盲測1次。

1.3.4.1 自動進樣器條件

孵化溫度：80 ℃；孵化時間：20 min；進樣方式：頂空進樣；進樣體積：500 μL；進樣針溫度：85 ℃；加熱方式：振蕩加熱；振蕩速度：500 r/min；不分流；清洗時間：5 min。

1.3.4.2 GC條件

色譜柱：FS-SE-54-CB-1；石英毛細管柱(15 m×0.53 mm，0.5 μm)；色譜柱溫度：40 ℃；載氣：N2(純度≥99.999%)；載氣流速：初始流速0～2 min，2 mL/min；2～10 min，2～20 mL/min；10～20 min，20～100 mL/min；20～30 min，100～150 mL/min；分析時間：30 min。

1.3.4.3 IMS檢測條件

漂移管長度：98 mm；管內線性電壓：500 V/cm；漂移管溫度：45 ℃；漂移氣：N2(純度≥99.999%)；漂移氣流量：150 mL/min；放射源：β射線(氚，3H)；離子化模式：正離子。

1.3.5 數據處理

利用FlavorSpec?配備的Laboratory Analytical Viewer(LAV)分析軟件及GC×IMS Library Search定性軟件對羊肚菌樣品的VOCs 進行采集和分析；利用軟件內置的NIST數據庫和IMS數據庫對物質進行定性分析；

化合物RI值計算方法：通過測試已知保留指數標品(2-丁酮、2-戊酮、2-己酮、2-庚酮、2-辛酮、2-壬酮)的保留時間，經FlavorSpec?自帶的GC×IMS Library Search軟件擬合出保留時間與保留指數RI的關系，再將羊肚菌GC-IMS捕捉到的VOCs的保留時間轉化為保留指數RI。

2 結果與分析

2.1 理化指標

羊肚菌中的多種營養成分具有良好的生物活性。蛋白具有脂氧合酶和葡聚糖裂解酶活性及抑制血小板聚集等作用[22]，多糖具有保肝、降血脂、增強免疫力、抗腫瘤抗氧化等生物活性[9-10]。植物多酚分子結構中的酚羥基基團可與體內的自由基結合，從而消耗自由基，因而植物多酚具有抗氧化、抗癌[23]等生物活性。由表1可知，林芝產羊肚菌蛋白質含量最高，達(32.61±0.04) g/100g，與其他3個產地的含量均有顯著差異(P<0.05)；4個不同產地樣品中的粗多糖含量差異顯著(P<0.05)，林芝最高；林芝和香格里拉樣品總酚含量相當，與長白山和青川有顯著差異(P<0.05)。總體來說，林芝產羊肚菌的蛋白質、粗多糖、總酚含量均較高，這可能與不同地區的海拔、氣候、光照、水分等種植條件的差異性有關。因此，在選擇加工原材料時，可根據產品對營養成分的需求來選擇適宜的產地。具體產地因素對羊肚菌基本營養成分的影響尚不明確，還需進一步擴大樣品數量，豐富產地類型，對產地的光照條件、氣候條件、土壤質地、栽培方式等因素做進一步研究。

表1 羊肚菌樣品的蛋白質、粗多糖、總酚含量Table 1 The contents of protein, crude polysaccharide and total phenol in Morchella spp.samples

2.2 游離氨基酸

食用菌的滋味是由各種不同呈味的游離氨基酸的平衡及相互影響共同決定的，對其風味具有重要作用。氨基酸是羊肚菌特征風味化合物之一，4種羊肚菌樣品的菌絲體中均富含氨基酸，其中總氨基酸和人體必需氨基酸的含量均較高，接近FAO/WHO推薦模式[24-25]。由表2可知，從4個產地的羊肚菌樣品中均檢測出17種氨基酸，包含7種必需氨基酸。各個含量指標中，長白山樣品的最高，除半胱氨酸和脯氨酸外，4個產地的樣品各指標呈顯著性差異(P<0.05)。谷氨酸、丙氨酸、精氨酸分別是鮮味、甜味、苦味氨基酸中含量最高的氨基酸。在必需氨基酸中，含量較高的為蛋氨酸、賴氨酸和亮氨酸，且4個產地呈顯著性差異(P<0.05)。在游離氨基酸中，谷氨酸含量最高，該結果與熊丙全等[26]的研究結果一致，4種樣品呈顯著性差異(P<0.05)，其中長白山樣品中的含量最高，為41.013 mg/g。此外，4種樣品的鮮味、甜味、苦味氨基酸總量差別較大，含量分別為49.397～65.291、54.409～64.741、103.312～127.917 mg/g，呈顯著性差異(P<0.05)。谷氨酸、天冬氨酸均可提供鮮味，且在4個產地的羊肚菌中含量均較高，這是羊肚菌具有特殊鮮味的主要成因之一。本實驗中，各樣品中的氨基酸含量差異較大，這可能與不同產地的土壤質地、光照、氣候和培育方式有關。

表2 不同產地羊肚菌的氨基酸含量檢測Table 2 Determination of content of amino acids in Morchella spp.samples from different habitats

2.3 GC-IMS數據分析

2.3.1 羊肚菌的GC-IMS分析

圖1是羊肚菌樣品GC-IMS譜圖中VOCs的指紋圖譜。Y軸為羊肚菌樣品編號(每1行為1個羊肚菌樣品的指紋圖，每種羊肚菌樣品平行測定3次)，X軸為VOCs的編號。圖中點的顏色深淺和點的面積表示VOCs含量大小，顏色越深、面積越大則含量越高[27]，白色點的VOCs含量較低，而紅色點則含量較高。如圖1所示，平行測定的羊肚菌樣品含有共有VOCs，僅區別于濃度大小，樣品組內具有明顯的相似性，樣品組間則呈現出明顯的差異性。林芝產羊肚菌樣品的VOCs的種類和含量均高于其他3個產地的樣品，因此，林芝產羊肚菌的風味最為獨特；香格里拉產羊肚菌的VOCs種類最少。這可能與不同地區的光照、海拔、氣候、土壤質地以及水分等種植的條件以及栽培方式有關。

由圖1可知，4種樣品中共檢測出84種VOCs，通過與FlavorSpec?內置的NIST 2014氣相保留指數數據庫和G.A.S的IMS遷移時間數據庫進行二維定性，確定了23種VOCs(表3)。結合圖1和表3可知，A框區域(1～33號VOCs)為羊肚菌樣品的共有區域峰，主要包括：2-苯乙醇、壬醇、苯乙醛、2-乙基己醇、辛醛、庚醇、甲硫基丙醛、己醛、丁酸、丁酸乙酯、1-己醇；B框區域(34～36，65～83號VOCs)為林芝產羊肚菌樣品(LZ)的特征峰區域，主要包括：γ-丁內酯、2-丁酮、異丁醇、1-戊醇、戊醛、3-甲基-1-丁醇、3-甲基丁醛；C框區域(37～41號VOCs)為香格里拉產羊肚菌樣品的特征峰區域；D框區域(43～48號VOCs)為長白山產羊肚菌樣品的特征風味區域；E框區域(49～61號VOCs)是長白山產羊肚菌樣品和青川產羊肚菌樣品共有的特征峰區域，主要包括：乙酸乙酯、3-甲基丁酸、2-甲基丁酸乙酯、丁醛。未鑒定出的61種VOCs待進一步研究。

表3 不同產地羊肚菌VOCsTable 3 The VOCs of Morchella spp.samples from different habitats

圖1 不同產地羊肚菌的HS-GC-IMS的指紋譜圖Fig.1 Fingerprint of HS-GC-IMS of Morchella spp.samples from different habitats

2.3.2 不同產地羊肚菌的PCA

將不同產地羊肚菌樣品所有的VOCs進行PCA，結果如圖2所示。PC_1[43%]與PC_2[33%]之和為76%，說明降維時保留了VOCs的主要有效信息。4種羊肚菌樣品各自成組，而盲樣(圖中4個黑點)也落在相應的組別中，說明通過檢測羊肚菌樣品的VOCs，進行主成分分析，對羊肚菌產地的區分是可行的。PC_1[43%]可將長白山、林芝樣品與青川和香格里拉樣品進行區分；而長白山、青川和香格里拉3個產地的樣品的PC_2接近；青川和香格里拉樣品PC_1與PC_2均相近，2種樣品的風味相似，但各自成組。林芝產羊肚菌樣品PC_1和PC_2與其他3個樣品差異較大，說明林芝產羊肚菌的揮發性風味獨特，可能為林芝海拔較高，其特殊環境導致其特殊風味的形成。長白山產羊肚菌樣品的PC_1與其余3個產地樣品差異較大，可能是長白山緯度比其余3個產地更偏北，其嚴寒氣候條件導致羊肚菌特殊風味的形成，但要闡明產地因素對羊肚菌揮發性風味物質種類和含量的具體影響，還需擴大樣品量做進一步的研究。

圖2 不同產地羊肚菌樣品的主成分分析Fig.2 The principal component analysis of Morchella spp.samples from different habitats注:圖中黑點表示盲測樣品

2.3.3 熱圖聚類分析

對不同產地羊肚菌樣品的VOCs進行熱圖聚類分析，結果如圖3所示。Y軸為已鑒定的各VOCs的編號，X軸為各產地羊肚菌樣品編號。由熱圖聚類分析結果可知，林芝產羊肚菌樣品的VOCs最為特別，單獨一組，其次是長白山樣品再分組。由此可知，產地的高海拔和嚴寒氣候對羊肚菌樣品風味的形成有影響，青川和香格里拉樣品風味相似。熱圖聚類分析的結果與PCA結果一致。

圖3 不同產地羊肚菌樣品的熱圖聚類分析Fig.3 The heat map cluster analysis of Morchella spp.samples from different habitats

2.3.4 不同產地羊肚菌的VOCs變化分析

已定性的23種VOCs的名稱、CAS號、保留時間、漂移時間如表3所示。醇類化合物主要來源于醛類的還原[28]和脂肪氧化[29]，直鏈飽和醇閾值普遍較高，對風味貢獻不大，包括：壬醇、庚醇等。醛類化合物主要來源于脂肪氧化，氨基酸反應亦是重要來源，且醛類閾值很低[29]，對羊肚菌的風味貢獻較大。檢出的醛類共有8種，包括：苯乙醛、辛醛、甲硫基丙醛、己醛、庚醛、丁醛、戊醛、3-甲基丁醛。其中，己醛具有葉香、果香，3-甲基丁醛稀釋后具有愉快的水果香氣[30]，主要存在于LZ中，醛類化合物是羊肚菌風味的重要組成部分。脂質氧化降解的另一類產物為酮[29]，羊肚菌樣品中鑒定出具有果香味的2-丁酮，主要存在于LZ中。脂肪酸與醇類化合物的酯化反應產生酯類化合物，酯類化合物一般呈現香甜果味[29]。已定性的4種酯分別是：丁酸乙酯、γ-丁內酯、乙酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯。已定性的2種酸分別是丁酸和3-甲基丁酸。羊肚菌風味的具體成因還有待進一步研究。

3 結論

本文對4個產地(長白山、林芝、青川、香格里拉)羊肚菌樣品的蛋白質、粗多糖、總酚、游離氨基酸和揮發性風味成分進行了分析，發現林芝產羊肚菌的蛋白質、粗多糖、總酚含量均最高，長白山產羊肚菌游離氨基酸、必需氨基酸總量均最高，所有氨基酸中谷氨酸含量最高，說明羊肚菌鮮味明顯。基于GC-IMS技術對樣品VOCs進行采集分析，通過繪制GC-IMS指紋圖譜，確定了各產地樣品的特征峰區域，通過主成分分析，不同產地的羊肚菌樣品得到了較好的區分，盲品亦能準確歸屬。熱圖聚類分析的結果與PCA結果一致，說明基于GC-IMS檢測技術，對不同產地羊肚菌樣品的VOCs進行檢測分析，以辨別產地是可行的。關于生態環境、氣候條件、栽培方式等因素對羊肚菌的風味和理化性質的具體影響機制，尚待深入研究。