基于液質聯用技術對早期高脂血癥金黃地鼠肝臟鞘脂的靶向代謝組學研究*

孫明謙 苗 蘭 張 穎 彭 勍 楊會珍 劉建勛 林 力

(中國中醫科學院西苑醫院基礎醫學研究所，中藥藥理北京市重點實驗室，北京 100091)

動脈粥樣硬化是一種由多種因素引起的慢性炎癥性疾病，其內皮損傷與脂質過氧化有關[1-2]。引發和加速動脈粥樣硬化的一個主要原因是高脂血癥導致氧化應激和炎癥的增加，高脂血癥是目前誘發心腦血管疾病的重要因素之一[3]。肝臟通過從血清中清除膽固醇和甘油三酯，在脂質代謝中發揮重要作用。因此，對肝臟代謝變化的描述對于高脂血癥的分子機制研究具有重要意義[4]。

鞘脂(sphingolipids)一類含有鞘氨醇骨架的兩性脂，是生物膜中的一類主要脂類，也是細胞信號傳遞中的一種生物活性脂類介質[5]。它能調節細胞的生存、增殖、凋亡、分化、遷移和免疫反應等重要生理過程。越來越多的研究表明，鞘脂在動脈粥樣硬化斑塊的形成和發展中起著重要作用，并導致心血管疾病[6-7]。 在高脂血癥的情況下，肝臟經常遭受嚴重的脂肪堆積、炎癥和氧化應激的損害。這些損傷與鞘脂中神經鞘磷脂(sphingomyelin,SM)-神經酰胺(ceremide,Cer)-鞘糖脂(glycosphingolipids)之間的代謝密切相關，這一代謝途徑在鞘脂類成分的代謝中占有重要地位，它們之間的相互代謝也與多種疾病的發生發展密切相關[8]。神經酰胺占據了這一途徑的中心樞紐，它們是一個緊密的系統，彼此密切相關和相互作用。因此，研究這一途徑在動脈粥樣硬化早期發病機制中的變化具有重要意義[9]。本研究主要針對鞘脂中的神經鞘磷脂、神經酰胺及葡萄糖神經酰胺(glucosyl-ceramide，Glc-cer)建立靶向代謝組學方法，圍繞這一代謝途徑進行系統研究，以期為動脈粥樣硬化的治療找到新的治療靶點。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

UltiMateTM3000超快速液相色譜、Q ExactiveTM四極桿軌道離子阱質譜、Mikro 220R真空離心濃縮儀(ThermoFisher Scientific)；Mix-3000震蕩混勻器(杭州米歐儀器有限公司)； LAbOSPEC T003日立全自動生化儀、TG、TC、LDL-C 及 HDL-C測定試劑盒(HITACHI)；臺式高速冷凍離心機(Hettich)； BX51顯微鏡(Olympus)。

高脂飼料(10 kg/箱)，A級，購自北京科澳協力飼料有限公司；乙腈、異丙醇、甲醇、水和甲酸為高效液相色譜級，購自Fisher Scientific；醋酸銨購自Sigma-Aldrich。

1.2 動物實驗

18只SPF級敘利亞金黃地鼠，雄性，7周齡，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物生產許可證號：SCXK(京)2016-0011，合格證編號11400700209462。金黃地鼠適應性飼養一周后分組，分為正常對照組(n=9)和高脂血癥模型組(n=9)。高脂血癥模型組飼喂高脂飼料6周，正常對照組飼喂常規飼料。實驗結束時，所有金黃地鼠均隔夜禁食不禁水。采血后將肝臟用生理鹽水沖洗，一部分肝臟取出后立即注入液氮，儲存在-80 ℃；另一部分肝臟進行固定、HE染色后觀察組織學變化。血液樣本經4 ℃、12 000 r/min，離心10 min，按血液生化指標試劑盒的操作說明進行相關生化指標檢測。

1.3 樣品處理與液質條件

1.3.1樣本處理：稱取適量組織肝臟，研磨后，加1 mL甲醇混勻。混勻震蕩30 min，然后在4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，取上層溶液100 μL，置于200 μL內襯管中，待測。

1.3.2液相條件：流動相為A(乙腈∶水=6∶4，0.1%甲酸，10 mmol/L乙酸銨)和B(異丙醇∶乙腈=9∶1，0.1%甲酸,10 mmol/L乙酸銨)；洗脫程序: 20%B；1 min，20%B；11 min，100%B；13 min，100%B；16 min，20%B；停止色譜柱: Waters UPLC HSS T3(1.8 μm，2.1 mm×100 mm)；流速：0.3 mL/min；進樣量：1.0 μL；柱溫：45 ℃。

1.3.3質譜條件：正離子離子源電壓分別為3.7 kV；毛細管加熱溫度320 ℃；翹氣壓力30 psi，輔助氣壓力10 psi；容積加熱蒸發溫度300 ℃；翹氣和輔助氣均為氮氣；碰撞氣為氮氣，壓力為1.5 m Torr；一級全掃描參數為：70 000 dpi，自動增益控制目標為1×106，最大隔離時間50 ms，質荷比掃描范圍50～1 500；液質系統由Xcalibur 2.2 SP1.48軟件控制，數據采集和靶向代謝物定量處理均由該軟件操作。

1.4 數據采集與分析

根據已建立方法，將原始LC-MS數據導入Skyline軟件分析39種靶向鞘脂。在建立的極性脂質數據庫中，根據保留時間和準確質量對鞘脂種類進行相對定量。使用SIMCA-P 12.0軟件進行多變量分析[10]。

2 結果

2.1 血清參數比較

結果見表1所列。高脂血癥模型組TG、TC、LDL-C，HDL-C水平明顯高于正常對照組，均具有統計學差異(P<0.01)。

表1 金黃地鼠血清中TG、TC、LDL-C 及 HDL-C 水平Table 1 Level of serum TG，TC，LDL-C and HDL-C in hamsters

2.2 組織病理學

如圖1所示，正常對照組肝組織結構正常，肝細胞索圍繞中央靜脈呈放射狀分布，排列整齊有序，肝竇充盈、可見，肝細胞未見腫脹變性，匯管區未見炎細胞浸潤及纖維組織增生。

圖1 HE 染色的病理圖(×200)Fig.1 Micrographs of hyperlipidemia hamster(×200)

高脂血癥模型組肝組織結構紊亂，肝細胞大片氣球樣變性，灶性小泡性脂肪變，肝細胞肥大致肝竇不明顯，枯否細胞增生，肝小葉內可見炎細胞聚集灶，匯管區輕度炎細胞浸潤及纖維組織增生。

2.3 多元數據分析

圖2顯示了肝勻漿液靶向代謝組研究的PCA和PLS-DA評分圖。結果表明，與正常對照組比較，高脂血癥模型組肝臟鞘脂代謝變化更為顯著。數據模型顯示區分效果良好，相關參數：對于PLS-DA模式(R2Y=0.993，Q2=0.939)，PCA(R2X=0.866，Q2=0.729)。VIP值反映了各變量(代謝物)對分類的影響，經PLS-DA處理后生成。從t檢驗中篩選出VIP>1、fold變化>1.5、P<0.05的潛在生物標志物進行進一步研究。共鑒定出21種潛在的鞘脂生物標志物，包括8種SM、4種Glu-cer和9種Cer。潛在生物標志物變化趨勢見圖3。

圖2 基于LC-MS的PCA和PLS-DA評分圖Fig.2 PCA and PLS-DA score plots based on data from LC-MS

圖3 肝臟鞘脂熱圖Fig.3 Heatmap of the sphingolipids in liver

3 討論

越來越多的證據表明，鞘脂代謝途徑的主要成分在心血管疾病、肥胖癥、糖尿病、胰島素抵抗和非酒精性脂肪肝疾病中都起著重要作用[11-13]。 鞘脂中各類成分之間的相互代謝都發揮著重要的生物學功能，如鞘磷脂與神經酰胺之間的代謝被激活會發揮促炎癥、促氧化和細胞死亡誘導活性，導致動脈粥樣硬化，衰老和心血管事件。 此外，近年來也發現鞘磷脂-神經酰胺-鞘糖脂通路中的成分作為潛在的次級信使分子直接或間接影響細胞和亞細胞器，在胰島素抵抗和脂肪肝的病理狀態中發揮著重要作用，可能是新的治療靶點[14]。本研究發現高脂血癥患者肝臟中4種Glc-cer和5種鞘磷脂呈下降趨勢，另外3種鞘磷脂和9種神經酰胺均呈上升趨勢，提示鞘脂代謝的整體異常。

神經酰胺在各種鞘脂的合成和分解代謝中起著關鍵作用。在鞘磷脂-神經酰胺-鞘糖脂途徑中，神經酰胺的主要是通過鞘磷脂酶水解神經鞘磷脂而生成[15]，而葡萄糖神經酰胺和半乳糖神經酰胺通過葡萄糖基轉移酶的分解生成神經酰胺[16]。神經酰胺被認為是胰島素抵抗和不同器官炎癥的重要脂質介質。許多研究表明神經酰胺與胰島素敏感性呈負相關，與炎癥呈正相關，肥胖的嚙齒動物和人類的血清和肝臟中神經酰胺的含量都會升高[17-18]，血脂異常和炎癥是非酒精性脂肪肝和動脈粥樣硬化發病的共同關鍵因素。肝代謝異常不僅導致脂肪肝脂肪變性的發生，而且增加了動脈粥樣硬化的風險。此外，升高的肝神經酰胺可能導致循環神經酰胺水平升高，從而通過直接損傷血管內皮促進動脈粥樣硬化[19]。

鞘磷脂是脂蛋白中含量最豐富的鞘脂，約占血漿總鞘脂的87%，占血漿總磷脂的20%。鞘磷脂由神經酰胺通過鞘磷脂合酶產生[20]。和神經酰胺一樣，鞘磷脂也是心血管疾病的危險因素，據報道，主動脈中高濃度的鞘磷脂可能有害，致動脈粥樣硬化的脂蛋白，如VLDL和LDL都是富含鞘磷脂的[21]。高脂血癥金黃地鼠肝臟中鞘磷脂水平呈現不同的變化趨勢，大部分鞘磷脂呈顯著的減少趨勢，這也可能表明鞘脂代謝的被激活的方向是產生神經酰胺，而不是生成鞘磷脂。但由于SM的組成復雜，含量高，其代謝異常的機制有待進一步研究。葡糖神經酰胺是由葡糖神經酰胺合酶(GCS)引起的神經酰胺糖基化反應形成的，GCS將葡萄糖與神經酰胺的1-羥基連接起來。葡糖神經酰胺與炎癥、糖尿病和動脈粥樣硬化密切相關[22]。本研究中Glc-cer的降低可能表明神經酰胺的糖基化作用降低，導致神經酰胺的升高[19]。

從文獻中可以看出，這三種成分對肝臟和心血管系統都有不良影響。然而，在高脂血癥的早期，鞘脂的變化并不是都升高，其代謝途徑主要還是朝著激活生成神經酰胺的方向變化[8]。神經酰胺在鞘脂的代謝過程和生物功能方面，都發揮著中心作用[23]。根據我們的研究，在高脂血癥的早期，神經酰胺和鞘磷脂或葡萄糖神經酰胺之間的肝臟平衡被打破，可能導致神經酰胺升高的原因之一，脂質代謝的異常，最先導致神經酰胺的升高，其可能引起肝功能異常，從而導致包括鞘脂在內的脂質代謝的進一步紊亂。

本研究采用液質聯用技術，對高脂血癥金黃地鼠肝組織中的鞘脂類成分進行了靶向代謝組學研究。21種與動脈粥樣硬化高度相關的鞘磷脂、神經酰胺和葡糖基神經酰胺在高脂血癥倉鼠肝臟出現異常改變。其中，只有神經酰胺呈現較為明顯上升趨勢，表明鞘脂的代謝途徑中被激活的生成是神經酰胺的途徑，提示神經酰胺的增加可能是倉鼠動脈粥樣硬化早期肝臟病變的主要特征。這種增加可能進一步導致鞘脂代謝功能障礙，甚至導致脂質損傷肝臟或內皮細胞。研究也表明，基于LC-MS的靶向代謝組學是進一步了解動脈粥樣硬化早期脂質功能障礙機制的有效工具。