DRD1基因敲除影響雄鼠生育的分子機理研究*

龔曉娟 馬 盼 孫 敏 楊婧思 李少卿王興林,2 張 平 閻春霞 張 寶

(1. 西安交通大學衛生部法醫學重點實驗室，西安 710061)(2. 西安交通大學環境與疾病相關基因教育部重點實驗室，西安 710061)

動物生殖性狀主要受下丘腦-垂體-性腺軸(HPG軸)的調控，關于動物生殖的研究大多是集中在HPG軸分泌的激素及其受體基因上[1]。其中，多巴胺(dopamine，DA)占哺乳動物大腦中兒茶酚胺類神經遞質含量的80%，控制著運動、認知、情感、攝食、內分泌調節等多種功能[2-4]。已知的多巴胺受體(DR)有5種(D1～D5)，可分為D1樣家族受體和D2樣家族受體。多巴胺D1受體屬于DR1樣受體，主要表達于尾殼核(CPu)、伏隔核(Acb)、視束(OT)、腦皮層(Cx)和杏仁核[5]，其功能主要包括影響情感思維及神經內分泌(帕金森病、精神分裂癥、阿爾茨海默癥)、參與藥物依賴形成、調控精神分裂癥、認知功能、影響學習記憶能力、保護視神經等。在小鼠體內定向敲除DRD1基因會提供關于它們生理功能的有研究價值的信息。例如，在各種海馬依賴的空間任務中，DRD1基因敲除小鼠學習和記憶能力明顯下降[6-7]。一些研究表明DRD1基因在下丘腦和垂體中廣泛表達，且該基因的表達參與雞、鴨、鵝等禽類生殖行為的調節[8-10]。但是DRD1基因調控生殖力的作用及其分子機制尚不清楚。為了進一步探究DRD1基因對生殖功能的影響，解析我校飼養的DRD1敲除小鼠表現的生殖能力下降，仔鼠成活率低等現象，本研究以DRD1敲除小鼠為研究對象，對DRD1敲除雄性小鼠的生殖性狀進行分析，旨在探究DRD1在雄性生殖功能中發揮的作用，明確DRD1敲除小鼠生殖能力下降的分子機理。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物：DRD1-/-小鼠(KO)、C57BL/6小鼠(WT)購自西安交通大學實驗動物中心，實驗動物生產許可證號：SCXK(陜)2018-001。多巴胺DRD1基因敲除小鼠(KO)，由美國芝加哥大學(University of Chicago)徐明教授惠贈。

1.1.2試劑儀器： RNA提取試劑盒(上海寶曼生物科技有限公司)，反轉錄試劑盒和SYBR Premix Ex TaqⅡ(TaKaRa BIO INC)，PCR儀和qRT-PCR儀(Bio-Rad)，組織切片機(Leitz)。

1.2 方法

1.2.1飼養條件：實驗動物飼養在西安交通大學醫學部實驗動物中心按照SPF級標準飼養，實驗動物使用許可證號: SYXK(陜)2015-002，溫度控制在18～22 ℃，相對濕度控制在50%～60%，光照明暗交替12 h/12 h。鼠盒、墊料均經過高壓消毒(131 ℃、5 min)，飼料用60Co照射滅菌，由北京科澳協力飼料有限公司提供，動物飲用水為酸化純凈水(pH 2.5～3.0)。飼料、水供給充足，墊料每2～3天更換1次。

1.2.2樣本收集：DRD1-/-純合小鼠經過檢驗檢疫、測序鑒定，檢測合格后進行分組實驗。取8周齡SPF級DRD1-/-雄性小鼠和WT雄性小鼠各5只。測小鼠體質量，取出小鼠雙側睪丸，稱質量，計算睪丸臟器系數。一側睪丸在篩網中用TRIzol充分研磨，-80 ℃保存；另一側睪丸用4%多聚甲醛/PBS固定。

1.2.3組織學分析：4%多聚甲醛溶液固定的睪丸組織常規石蠟包埋、組織切片、HE染色、中性樹膠封片、制作成睪丸組織病理切片，光學顯微鏡下觀察。對每個睪丸組織切片，選取 10 個圓形生精小管上皮，觀察生精小管的直徑及精原細胞，各級生精母細胞的分布及形態，睪丸間質的疏密程度及分布情況。

1.2.4基因表達差異分析:查閱文獻，選擇在睪丸組織中顯著表達并與生殖密切相關的8個候選基因：Spem1、Tex12、Spata19、Tnp2、CDY、CFTR、DAZ、SMCY以及內參基因GAPDH。利用TRIzol法提取睪丸組織RNA，經gDNA Eraser酶參照說明去除基因組DNA，反轉錄合成cDNA后進行qRT-PCR反應。結果分析采用相對定量法，根據2-ΔΔCt數值判斷實驗組某基因相對于對照組的表達量，以GAPDH作為內參。ΔCt=目標基因Ct值-內參基因Ct值；ΔΔCt=實驗ΔCt-對照ΔCt；相對表達量=2-ΔΔCt。一般認為2-ΔΔCt數值大于2表達上調具有顯著意義，小于0.5表達下調具有顯著意義[11]。

1.3 統計方法

2 結果

2.1 體質量及臟器系數計算

KO雄鼠體質量與WT雄鼠體質量相比具有顯著差異(P<0.05)；KO 鼠睪丸質量與WT鼠睪丸質量相比，未發現顯著差異(P>0.05)；KO 鼠睪丸系數與WT鼠睪丸系數相比，也未發現顯著差異(P>0.05)(表1)。

表1 KO與WT小鼠體質量及睪丸系數比較Table 1 Weight and testicularcoefficient in KO and WT

2.2 睪丸組織病理切片

肉眼觀察，睪丸組織未發現顯著差異。光學顯微鏡下觀察睪丸組織病理切片，與 WT 小鼠相比，發現KO 小鼠生精小管排列疏松紊亂，生殖細胞層數少。雖可見圓形精子，但精細胞與帶尾精子數量較少，提示精子形態及功能可能存在異常(圖1)。

圖1 WT與KO小鼠睪丸組織病理切片比較Fig.1 Comparison of pathological sectionsof testis tissue between WT and KO

2.3 qRT-PCR分析結果

KO小鼠相對WT小鼠，CFTR表達上調2.32倍，Spata19上調4.58倍，SMCY下調5.25倍，DAZ下調3.14倍，Tex12、CDY、Spem1和Tnp2未見明顯差異(圖2)。

圖2 WT與KO小鼠基因表達差異倍數Fig.2 Fold change in differential gene expressionbetween WT and KO mice

3 討論

多巴胺DRD1基因被認為與精神分裂癥、藥物依賴、孤獨癥等多種精神類疾病相關，在下丘腦和垂體中有著廣泛分布，DRD1-/-小鼠，作為多巴胺受體介導的神經及生理活動動物模型被廣泛應用于藥物成癮、精神分裂等的研究[12-15]。本實驗室在對該動物模型進行飼養的過程中，發現DRD1-/-小鼠出現生殖能力下降、仔鼠成活率低等現象。由于動物生殖主要受下丘腦-垂體-性腺軸的調控，而DRD1基因在下丘腦和垂體中廣泛表達，推測DRD1基因可能通過下丘腦-垂體-性腺軸參與小鼠生殖的調控。故本研究從病理生理學指標及基因表達水平對DRD1-/-雄性小鼠睪丸生殖功能進行分析，以期為生殖生理的研究提供新的思路。

CFTR編碼囊性纖維化跨膜轉運調節因子，在呼吸道、腸道、生殖道等腔上皮細胞內多有表達，其突變可以導致多種發育缺陷的發生。大量研究表明，CFTR的突變和蛋白表達異常是男性生殖道中先天性輸精管缺如[16]、男性梗阻性無精子癥及不育的重要因素[17]。但關于CFTR對生精功能是否造成影響，學術界一直存在爭議，CFTR在睪丸上的表達分布情況也鮮有報道。有研究表明先天性雙側輸精管缺如患者睪丸組織的CFTR表達以陽性和弱陽性為主，也可見強陽性和少部分的陰性[18]。本研究發現DRD1-/-小鼠CFTR睪丸上表達上調2.32倍，推測DRD1基因敲除損傷睪丸生精功能可能與CFTR表達異常有關。Spata19是與生殖相關的一個重要的基因，已被鑒定與精子發生及前列腺癌等其他重要生殖疾病有關。Spata19通過調控線粒體功能影響精子活動性[17]，可影響精子頭部的形狀[19]，在精子的發生過程中起重要的作用[20]。本研究檢測到DRD1-/-小鼠的Spata19基因表達上調4.58倍，劉若巖[21]研究表明該基因表達水平的增加可能會影響精子的結構穩定，也可能使精子提前獲能，從而影響雄性小鼠的生殖功能。

與之相反的是，本研究中KO小鼠的SMCY基因與DAZ基因較WT小鼠表達顯著下調，SMCY下調5.25倍，DAZ下調3.14倍，這與組織學水平發現精細胞及帶尾精子數量少相一致。SMCY編碼一種男性特有的組織相容性抗原，其突變或缺失與無精或少精相關，是一種生精因子[22-23]，DRD1-/-小鼠睪丸組織中SMCY基因表達的下調，證明DRD1基因的敲除影響了睪丸生精功能，損害小鼠的生殖功能。基因DAZ編碼在精原細胞和減數分裂早期生精細胞中特異性RNA結合蛋白，是激活精子和保持種族 Y 染色體功能的重要基因[24-26]。DRD1-/-小鼠睪丸組織中DAZ基因表達的下調，會導致精子發生過程中聯會的失敗，從而致使DRD1-/-小鼠的生精功能低下、生殖功能下降。

以上基因的差異表達對精子的發生發展，睪丸組織的形態具有顯著影響。敲除小鼠DRD1基因后，與生殖相關的基因表達發生相應的上調或下調，從而影響生殖器官及精子生成，導致生殖能力下降。由此推測，DRD1基因可能通過影響雄鼠體內與生殖密切相關基因的表達情況，間接影響精子的發生、睪丸組織的形態，進而影響生殖。但其明確的關系，仍需進一步研究。為了明確DRD1基因與小鼠生殖性狀及生殖力之間的關系，下一步具體可從KO與WT雄性小鼠的生殖行為學、性激素測定、蛋白組學和高通量分析技術(如基因芯片)等幾方面進行深層次研究。本研究從組織學水平，基因水平對小鼠生殖性狀的影響進行了初步探討。DRD1基因如何調控生殖通路的具體靶點，有待進一步探究。