正交試驗設(shè)計探索小鼠不同組織冰凍切片的優(yōu)化制備方法*

房彬彬 孫 立 劉 芬 羅俊一 楊 寧李艷紅 王 黎 田 婷 楊毅寧

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究院，省部共建中亞高發(fā)病成因與防治國家重點實驗室,烏魯木齊 830054)(2.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院冠心病一科，烏魯木齊 830054)(3.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗中心，烏魯木齊 830054)

冰凍切片因其快速、簡便、較好的保存抗原活性及酶類等優(yōu)點[1]，在病毒轉(zhuǎn)染效率分析、油紅O染色、免疫熒光等實驗中具有不可替代的優(yōu)勢，目前被廣泛應(yīng)用于臨床病理快速診斷和科學(xué)研究中[2-4]。在醫(yī)學(xué)科研工作中，實驗標(biāo)本多來自于動物模型，如小鼠、大鼠、兔、犬等，其中尤以小鼠最為普遍[5]。但是在制片過程中，由于各種組織中所含水分的不同、質(zhì)地軟硬的差異以及組織中形態(tài)結(jié)構(gòu)和成分的多樣性等因素[6-7]，如運用相同的固定、脫水、包埋等方法，常出現(xiàn)組織過度收縮或腫脹、過脆無法制片、冰晶形成過多、脫片等問題[8]，導(dǎo)致組織細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變[9]，嚴(yán)重影響冰凍切片的質(zhì)量及結(jié)果的判讀。為此，本研究選擇小鼠常規(guī)器官組織，探索各組織在冰凍切片制備過程中的最佳固定、脫水方法，切片溫度以及切片厚度，為高質(zhì)量冰凍切片的制備提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物取材：昆明小鼠，雌性，3只，購自新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，實驗動物使用許可證號：SYXK(新)2018-0003，分別取心、肝、脾、腎、大腦、主動脈及腓腸肌。

1.1.2儀器設(shè)備：Leica CM1950冰凍切片機和Leica DM 3000顯微鏡。

1.1.3試劑及耗材：OCT冷凍切片包埋劑美國櫻花SAKURA、蘇木素染色液(ZLI-9610)及伊紅染色液(ZLI-9613)均購自北京中杉金橋公司；環(huán)保透明脫蠟液(YA0031)購自北京索萊寶科技有限公司；4%多聚甲醛通用型組織固定液購自Biosharp Life sciences；蔗糖、75%乙醇、95%乙醇與無水乙醇均購自天津永晟精細(xì)化工公司；包埋模具購自美國Fisherbrand；切片機刀片徠卡819一次性刀片購自德國萊卡；防脫載玻片購自江蘇世泰實驗器材有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1正交實驗優(yōu)化冰凍切片方法：根據(jù)三個影響冰凍切片質(zhì)量的主要因素，即固定、脫水程序(A)，切片厚度(B)和冷凍溫度(C)，選擇SPSS 21.0軟件進行正交實驗設(shè)計。參考冰凍切片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)作為評價標(biāo)準(zhǔn)[10]。①組織完整性：細(xì)胞形態(tài)完整，細(xì)胞染色境界清楚(4分)；形態(tài)完整，境界欠清晰(3 分)；非關(guān)鍵部位缺失小于20%(2分)；關(guān)鍵部位缺失或非關(guān)鍵部位缺失大于20%(1分)。②組織開裂：無開裂(4分)；1條輕微裂隙不影響觀察(2分)；大于1條裂隙，但開裂不明顯(2分)；開裂明顯(1分)。③冰晶偽跡: 無偽跡(4分)；偽跡輕微不影響觀察(3分)；偽跡明顯不影響觀察(2分)；偽跡明顯影響觀察(1分)。④核漿對比度：核漿著色均勻，紅藍(lán)對比鮮明(4分)；核漿著色欠佳，紅藍(lán)對比較好(3分)；核漿著色淺，紅藍(lán)對比不明顯(2分)；核漿著色一致，無法分辨(1分)。正交實驗設(shè)計表見表1所列。

1.2.2固定、脫水程序：三種。不固定、不脫水：組織取材后，OCT包埋入模具中，液氮表面預(yù)冷15 s；固定、不脫水：組織取材后，4%多聚甲醛固定過夜，OCT包埋入模具中，液氮表面預(yù)冷15 s；固定、脫水：組織取材后，4%多聚甲醛固定過夜，依次浸入20%和30%蔗糖溶液脫水至沉底，OCT包埋入模具中，液氮表面預(yù)冷15 s。

1.2.3冰凍切片制備：將組織修整為5 mm×0.5 mm，厚度為2～3 mm。OCT包埋入模具中，液氮表面預(yù)冷15 s。冰凍切片機切片，防脫載玻片貼片，室溫風(fēng)干，進行HE染色。

1.2.4HE染色：將冰凍切片用4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗滌3次，5 min/次，入蘇木素溶液染色1.5 min，取出后自來水充分洗滌；鹽酸乙醇分化1 s，自來水終止，PBS返藍(lán)2 min，伊紅染色1 min，取出后自來水充分洗滌，入梯度乙醇脫水，環(huán)保透明脫蠟液透明，中性樹膠固封。使用Leica DM 3000顯微鏡進行圖像采集和分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計分析，不同組間均值比較采用主效應(yīng)方差分析。P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 正交實驗結(jié)果

按照切片質(zhì)量評價標(biāo)準(zhǔn)對各組織切片進行評分結(jié)果，見表2所列。主效應(yīng)方差分析結(jié)果顯示，不同組織對于固定步驟、溫度、切片厚度的要求不同，但結(jié)果顯示，僅有固定脫水程序的差異有統(tǒng)計學(xué)意義，且對于肝臟組織，最合適的步驟為固定后脫水；對于主動脈，不同的固定脫水程序、溫度、切片厚度間差異無統(tǒng)計學(xué)意義；而對于其他組織而言，不固定、不脫水的組織冰凍切片效果較好。由此可知，A因素對實驗結(jié)果影響顯著，而B因素、C因素對實驗結(jié)果影響較弱。由表3可知，對于肝臟組織，A3標(biāo)準(zhǔn)可以獲得較優(yōu)質(zhì)切片；對于肌肉、心、脾、腦、腎組織，A1標(biāo)準(zhǔn)可以獲得較優(yōu)質(zhì)切片；對于主動脈組織，由于A因素對切片質(zhì)量影響不大，但不固定、不脫水可提高組織抗原呈遞性，所以選擇A1標(biāo)準(zhǔn)。對于各個組織B因素與C因素對切片質(zhì)量影響不大，綜合各組織情況，建議選擇B2C2標(biāo)準(zhǔn)。綜上所述，肝臟組織最佳切片條件為A3B2C2，即固定后脫水，切片厚度控制在5 μm，-18 ℃切片；肌肉、心、脾、腦、腎、主動脈組織最佳切片條件為A1B2C2，即不固定、不脫水，切片厚度控制在5 μm，-18 ℃切片。

表2 L9(34)正交實驗設(shè)計Table 2 Orthogonal design L9(34)

表3 單因素統(tǒng)計表Table 3 Statistics of single factor

2.2 部分代表性組織切片

主動脈組織經(jīng)不同固定脫水程序后，將HE染色結(jié)果進行比較，可見不固定、不脫水(圖1A)，固定、不脫水(圖1B)以及固定、脫水(圖1C)三種步驟，組織結(jié)構(gòu)均完整、無皺折及冰晶、核質(zhì)分明。

圖1 各組小鼠主動脈HE染色結(jié)果(×400)Fig.1 HE staining results of aorta in mice of each group (×400)

除主動脈以外的其他組織，以小鼠腓腸肌和大腦組織為例，不固定、不脫水(圖2A、圖3A)方法冰凍切片完整、貼片平整、不易產(chǎn)生皺褶及冰晶，核漿對比度好，色彩鮮艷。固定、不脫水(圖2B、圖3B)組織細(xì)胞碎裂，核質(zhì)無法分辨。固定、脫水(圖2C、圖3C)貼片較平整、組織細(xì)胞有不同程度的碎裂及冰晶形成，核漿對比度一般。

圖2 各組小鼠腓腸肌HE染色結(jié)果(×400)Fig.2 HE staining results of gastrocnemius muscle in mice of each group(×400)

圖3 各組小鼠大腦HE染色結(jié)果(×400)Fig.3 HE staining results of brain in mice of each group(×400)

3 討論

冰凍切片技術(shù)在病理診斷中具有舉足輕重的作用[11-12]，常用于臨床手術(shù)科室快速組織病理學(xué)診斷，而在基礎(chǔ)研究中，冰凍切片除了觀察病理形態(tài)結(jié)構(gòu)變化以外，還要進行細(xì)胞蛋白定位、組織脂質(zhì)定位及含量測定、轉(zhuǎn)染效率分析等深入的研究，對冰凍切片技術(shù)及樣本的質(zhì)量要求很高，但冰凍切片的制備方法在文獻報道中差別較大，不同組織器官適宜的切片制備條件也有所不同[13]。本研究采用正交實驗設(shè)計，選擇三個影響冰凍切片質(zhì)量的主要因素，重點篩選小鼠常規(guī)組織冰凍切片的最優(yōu)方案，解決基礎(chǔ)研究中的具體技術(shù)問題，確保實驗結(jié)果的真實性和科學(xué)性。

冰凍切片的固定、脫水程序，由于各組織之間的形態(tài)結(jié)構(gòu)和組成成分上的差異，一直以來沒有一個確定的流程。張頔等[6]研究采用新鮮組織直接液氮速凍法處理皮膚、肝臟、腎臟等組織，伍剛等[10]使用4%多聚甲醛溶液灌注固定大鼠大腦前動脈-嗅動脈24 h，30%蔗糖脫水24 h 至標(biāo)本沉底。金云濤等[14]經(jīng)流水沖洗豬肺24 h，浸泡于20%蔗糖24 h，30%蔗糖3 d。本研究在總結(jié)了多個研究結(jié)果的基礎(chǔ)之上，選擇了三種程序，確定了不同組織最佳的固定和脫水方法。

切片溫度是保證切片質(zhì)量的關(guān)鍵因素，溫度過低，組織硬度大，可能導(dǎo)致組織破碎，切片產(chǎn)生裂痕，溫度過高組織硬度不夠，造成黏片、OCT與組織脫離、切片褶皺等情況[15]；厚度的調(diào)整也是必須的，以適應(yīng)各種類型的組織，切片過厚，組織特征變得模糊影響觀察，而過薄將造成切片殘缺不完整[16]。因此，不同組織標(biāo)本冰凍切片時，需要調(diào)整到適宜的切片溫度及厚度。

如果將三因素、三種水平分別實驗，觀察對切片的影響，實驗成本大且周期長。而通過正交試驗設(shè)計和分析方法，能夠?qū)崿F(xiàn)以最少的試驗次數(shù)達(dá)到與大量全面試驗等效的結(jié)果，提高了實驗效率，減少實驗動物數(shù)量，節(jié)約實驗成本[17]。通過正交試驗法，優(yōu)化了切片條件，各組織有其不同的固定、脫水程序，切片溫度以及切片厚度，提高了常用組織的冰凍切片制備的質(zhì)量及效率。