HMGB1-TLR4/RAGE信號通路在ALI/ARDS中的研究進展

秘樂 范紹輝 徐宇 舒小燚 王紅嫚

遵義醫科大學第五附屬(珠海)醫院呼吸與危重癥醫學科519100

急性肺損傷 (acute lung iniury,ALI)/ARDS是非心源性因素導致的肺泡上皮細胞及毛細血管內皮細胞損傷,導致急性、頑固性呼吸窘迫。2012年柏林定義取消了ALI命名,將本病統稱為ARDS[1],但在動物實驗研究中暫無統一的命名標準。其發病機制復雜,尚無有效治療措施。高遷移率族蛋白B1 (high-mobility group box 1 protein,HMGB1)可能是啟動、維持和加劇瀑布式炎癥級聯反應的重要晚期炎性因子[2-4]。當細胞外的HMGB1結合到細胞表面受體時,如晚期糖基化終產物受體 (receptor for advanced glycation end products,RAGE),Toll 樣受體(Toll-like receptors,TLR)家族中的TLR2、TLR4[5]、TLR9[6]及趨化因子CXCL12[7]等,可激活下游通路,誘導轉錄多種炎性因子[8]。近年來,HMGB1-TLR4/RAGE信號通路在ALI/ARDS中的作用逐漸引起大家關注,而尋找炎癥相關的潛在分子機制可能有助于確定ALI/ARDS新的治療靶點 (圖1)。

1 HMGB1與ALI/ARDS

1.1 HMGB1的結構、分布與功能 人類HMGB1基因位于13q12染色體上。HMGB1 是一種有215 個氨基酸的單鏈蛋白,由A-box、B-box和C-tail 3個結構域組成,其中B-box具有炎癥活性,而A-box對B-box有一定的拮抗作用[9]。HMGB1 廣泛存在于淋巴、腦、肺、肝、心、腎、脾等組織細胞中[10]。正常生理條件下,HMGB1作為一種胞核內DNA 結合蛋白,表達量穩定在基礎水平,在基因轉錄、基因調節及DNA 修復重組等過程中起重要作用[9,11]。在細胞應激、活化或凋亡、死亡過程中,HMGB1轉移至胞質和胞外基質[12-13],與相應受體結合,介導TLR4/RAGE等眾多下游信號通路參與免疫炎癥反應。

圖1 HMGB1-TLR4/RAGE相關信號通路

1.2 HMGB1在ALI/ARDS中的作用

1.2.1 HMGB1 放大炎癥級聯反應 HMGB1 作為ALI/ARDS炎癥反應進程中重要的晚期炎性因子,從胞核移至胞質,再由炎癥細胞將其釋放到胞外,可誘導炎性因子釋放、細胞聚集[13]、細胞分化[14]、細胞極化[5]等多種反應。胞外HMGB1 與細胞表面受體結合,如RAGE、TLR2、TLR4[5]、TLR9[6]等,進一步激活下游通路而發揮其生物學效應。此外,HMGB1可調節單核細胞的遷移[13],介導內皮細胞的高通透性[15],并激活巨噬細胞[13]、樹突狀細胞[16]、中性粒細胞等[5],使這些細胞釋放單核細胞趨化蛋白1 (monocyte chemotactic protein 1,MCP-1)、腫瘤壞死因子α (tumor necrosis factor-α,TNF-α)、IL-1β、IL-6、巨噬細胞炎性蛋白1β、IL-8、IL-18 等,從而調節免疫應答[5,13,16-17]。Sun 等[18]研 究 發 現H MGB1 的 增 加 誘 導 了TNF-α和IL-6的第2次釋放,表明了某些早期炎性細胞因子與H MGB1之間存在正反饋效應,從而在空間和時間上可進一步放大炎癥級聯反應。

1.2.2 H MGB1在炎癥反應中的時效性 關于HMGB1的時效性目前尚無統一定論。肺臟是膿毒癥最易被累及的靶器官,較早并發ALI/ARDS 是死亡的主要原因之一。Wang等[12]用脂多糖 (lipopolysaccharides,LPS)刺激鼠巨噬細胞樣RAW264.7細胞株,篩選出了培養基中18 h后明顯出現的HMGB1,但HMGB1 m RNA 的表達在16 h內沒有上調。說明HMGB1作為一種晚期炎性因子,與早發炎性因子相比具有顯著的釋放延遲動力學[18]。有學者在LPS誘導小鼠的肺炎癥和損傷中發現,誘導后2 h小鼠支氣管肺泡灌洗液中HMGB1 水平已能測定,6 h 更高[19]。而有研究發現HMGB1的釋放僅在LPS刺激RAW264.7細胞8 h后能被檢測到[20]。Chen等[21]使巨噬細胞暴露于煙草煙霧提取物8 h后,可明顯觀察到核HMGB1易位至胞質和質膜中,至24 h,HMGB1以可溶性分子或以微泡相關的形式釋放到胞外。而有學者發現能夠抑制HMGB1活性的藥物即使在疾病發作后48 h給予小鼠,也可顯著提高膿毒癥小鼠的存活率[22]。這些研究提示,盡管HMGB1是ALI/ARDS的晚期炎性因子,但它可能會在炎癥進程的短時間內表達其毒性。

1.2.3 HMGB1 可作為ALI/ARDS 新的治療靶點Hatayama等[23]用抗HMGB1單克隆抗體處理ALI小鼠后,小鼠肺組織彌漫性水腫和出血明顯減輕。LPS攻擊后,巨噬細胞、中性粒細胞及淋巴細胞的數量明顯增加,這種增加通過抗HMGB1處理后被顯著減弱,而重組HMGB1可提高促炎因子的水平,加劇炎性細胞的浸潤[5]。通過誘導HMGB1從胞核易位至胞質,可減少細胞自噬和凋亡,減輕呼吸機所致肺損傷[19]。減少HMGB1 的釋放也可減輕ALI的嚴重程度[24]。故HMGB1 可能是ALI/ARDS 有價值的臨床治療靶標。

2 TLR4與ALI/ARDS

2.1 TLR4的結構、分布與功能 TLR 是具有細胞外配體結合結構域、單個跨膜區段和胞質Toll/IL-1R 結構域的跨膜受體[25-26],其中TLR4基因位于9號染色體,主要在單核細胞、中性粒細胞中表達[27]。TLR4可識別LPS、肺表面活性蛋白A[28]、熱休克蛋白70[29]及HMGB1 等配體。其中LPS 刺激TLR4 后,可激活髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)和β 干擾素TIR 結構域銜接蛋白2種途徑,這2種途徑與其他信號通路的交互可使TLR4信號得到適當調節,最終活化核轉錄因子κB (nuclear factor-kappaB,NF-κB)和絲裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinase,MAPK)等信號通路,導致細胞激活或凋亡,以及促炎因子、趨化因子的轉錄[30-32]。

2.2 TLR4-NF-κB 信 號 通 路 在ALI/ARDS 中 的 作 用LPS、HMGB1等配體與TLR4 結合,通過不同途徑激活NF-κB信號通路,誘導下游趨化因子、細胞黏附分子及促炎因子大量釋放,募集中性粒細胞,使血管內皮細胞和肺泡上皮細胞受損[5,32-34]。一項膿毒癥致大鼠ALI研究中發現,大鼠肺組織中HMGB1、TLR4 和NF-κB 表達明顯升高,而在抑制HMGB1-TLR4-NF-κB 信號通路后肺的組織結構和功能有所改善,提示膿毒癥所致ALI與此信號通路激活密切相關[35]。Meng等[8]發現在使用右美托咪定干預LPS誘導的ALI后,降低了TNF-α、IL-6和IL-1β的釋放,抑制了HMGB1、TLR4、MyD88 和磷酸化NF-κB 通路蛋白的表達,有效減輕了大鼠肺損傷程度。而基因敲除MyD88后可降低TNF-α和NF-κB 的水平,減弱百草枯誘導的小鼠ALI[36]。通過抑制TLR4-NF-κB信號通路,可減輕ALI炎癥反應程度。

2.3 TLR4-MAPK 信號通路在ALI/ARDS 中的作用LPS與TLR4結合,激活MAPK 信號通路,導致機體對應激刺激的信號級聯反應。已有研究證實p38 MAPK、c-Jun氨基末端激酶 (c-Jun N-terminal kinase,JNK)/應激活化蛋白激酶及細胞外調節蛋白激酶 (extracellular signalregulated kinase,ERK)可能參與了ALI/ARDS 的發展[37],通過調節TLR4-MAPK 信號通路可改善LPS誘導的ALI。木蘭花堿可抑制p38 MAPK、JNK 和ERK 活化,從而降低LPS 誘導的ALI中TNF-α、IL-1β和IL-6 的水平[37]。有學者發現丹寧酸抑制LPS誘導的TLR4的表達可能與其抑制了ERK1/2 和p38 MAPK 的活化有關[38]。Wang等[39]在LPS致ALI的體內和體外研究中發現,LPS刺激以時間和濃度依賴性方式增加p38 MAPK 磷酸化,從而導致肺上皮通透性過高和肺水腫,而基因敲除TLR4可消除LPS介導的p38 MAPK 磷酸化,表明TLR4參與LPS誘導的肺上皮屏障功能受損并在p38 MAPK 的上游起作用。有研究發現,p38 MAPK 可能在LPS致NF-κB活化的上游起作用,抑制p38 MAPK 介導的NF-κB信號通路也可成為減輕肺部炎癥損害的措施[40]。

3 RAGE與ALI/ARDS

3.1 RAGE的結構、分布與功能 RAGE是免疫球蛋白超家族中的一員,作為一種多配體模式識別受體,與多種炎性疾病的發病有關。人類RAGE編碼基因位于6號染色體上。由RAGE基因轉錄的m RNA 可選擇性剪切產生20多種異形體,這些異形體的存在導致多種信號傳導胞質銜接子的存在[41]。生理狀態下,RAGE在肺上皮細胞中較高基礎水平表達,有助于維持肺泡上皮細胞的形態和特定結構,而在巨噬細胞、內皮細胞[42]等其他組織細胞中僅有低水平的表達[43]。病理條件下,RAGE 在內皮細胞[42]、單核細胞[44]等細胞中的表達迅速升高,并與相應配體結合,參與調節炎癥反應、細胞凋亡[45]等重要過程。當肺組織受刺激后可表達超生理水平的RAGE、HMGB1[46]和S100蛋白家族[47]等,它們相互作用,介導NF-κB、MAPK、酪氨酸激酶 (Janus kinase,JAK)/信號傳導和轉錄激活蛋白(signal transducer and activator of transcription,STAT)[48]等下游信號通路,產生炎癥和氧化應激,影響哮喘、COPD 和ALI等疾病的發生發展[49-50]。

3.2 RAGE-NF-κB 信 號 通 路 在ALI/ARDS 中 的 作 用NF-κB是RAGE下游介導體內炎癥反應的重要信號途徑之一,且RAGE-NF-κB信號傳導的激活可促進RAGE本身的轉錄,兩者之間形成正反饋回路,進一步介導促炎細胞因子分泌[51]。用LPS/HMGB1激活RAW264.7細胞后,新型RAGE拮抗劑降低了細胞表面RAGE 水平,抑制了NF-κB的核轉運,同時減少了TNF-α和IL-6的釋放,提示體外通過降低RAGE 介導的NF-κB 活化可減輕ALI[52]。在一項用氯胺酮治療LPS 致大鼠ALI的研究中,氯胺酮下調了RAGE、NF-κB 的mRNA 和 蛋 白 質 水 平,從 而 抑 制 了HMGB-1 mRNA 的上調[46]。這些結果表明,抑制RAGENF-κB信號通路可以作為治療ALI的新選擇。

3.3 RAGE-MAPK 信號通路在ALI/ARDS中的作用 在LPS誘導的ALI小鼠中,通過抑制JNK m RNA 和p38 MAPK 的表達可顯著抑制炎癥反應[53]。Xiao等[54]的研究結果表明,在體外和體內抑制JNK 磷酸化,可進一步抑制TNF-α、IL-6、IL-1β及COX-2 的表達,表明JNK 在誘導表達炎癥介質的上游途徑中有調節作用。Li等[55]發現氯胺酮抑制了大鼠ALI中肺組織HMGB1和RAGE的表達,可能部分是由于氯胺酮抑制了MAPK 的激活。且通過抑制RAGE-MAPK 通路可減少氧化應激、抑制自噬并降低炎癥反應,改善LPS誘導的ALI[56]。說明抑制RAGE-MAPK信號通路在ALI/ARDS臨床治療中具有潛在價值。

3.4 RAGE-JAK/STAT 信號通路在ALI/ARDS 中的作用 RAGE與HMGB1等配體結合后,可激活JAK/STAT信號轉導通路,誘導產生炎性細胞因子[48],可能是ALI/ARDS炎癥進程中的一個關鍵點。有研究發現使用小分子STAT3抑制劑LLL12可減輕炎性細胞浸潤,減少IL-1β和CCL2的表達,且LLL12減弱了ARDS患者血漿誘導的人外周血單核細胞中STAT3的磷酸化[57]。另一些藥物可通過部分抑制STAT3 轉移到胞核[58]、降低JAK1/JAK2-STAT1的總水平和磷酸化水平[59]而在LPS 誘導的小鼠ALI中發揮抗炎作用。而體外下調JAK2/STAT1磷酸化水平并誘導HMGB1從胞核轉移至胞質可減少細胞自噬與凋亡[19]。這些發現揭示了RAGE-JAK/STAT 途徑與ALI/ARDS的肺部炎癥、細胞自噬和凋亡之間的聯系。

4 展望

ALI/ARDS發病機制復雜,其中心概念之一是失控的瀑布式炎癥級聯反應。HMGB1 作為晚期炎性因子,其合成與釋放可影響ALI/ARDS的發生發展。HMGB1通過激活TLR4/RAGE等,進一步介導眾多下游信號通路,釋放多種炎性介質和趨化因子。由于完整的炎癥反應可能涉及多種不同但平行的信號途徑,故HMGB1 的時效性及TLR4/RAGE介導的多種炎性通路所占比例等尚無明確定論,而該反應涉及到的其他因素也需進一步探索。但目前的研究結果讓我們相信,進一步探尋這些分子在ALI/ARDS中的潛在作用機制,可為將來疾病的治療提供新靶點。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突