鈣通道突變致早期復極綜合征的電生理機制研究

陳秀 陳甘瀟 張中和 胡丹 夏豪

(武漢大學人民醫院心血管內科 武漢大學心血管病研究所 湖北省心臟重點實驗室，湖北 武漢 430060)

早期復極模式(early repolarization pattern，ERP)是指除外V1～V3導聯，12導聯心電圖上≥2個相鄰導聯出現J波(QRS波群終末切跡或頓挫)頂點(Jp)振幅≥0.1mV，QRS波群時限(在無切跡或頓挫的導聯上)<120 ms，伴或不伴ST段抬高。過去幾十年一直被認為是一種良性心電圖改變[1-2]。直到2000年，Gussak等[3]通過建立犬心室的楔形組織模型提出，這種“良性表現”有發展為多形性室性心動過速(室速)甚至心室顫動(室顫)的傾向。8年后，Ha?ssaguerre等通過多個臨床研究證實了這一假說[4-6]。隨后大量流行病學調查研究也發現，ERP(尤其是位于下/側壁)會增加惡性心律失常事件和心源性猝死的風險[7-8]。心電圖下壁和/或側壁導聯記錄到ERP，并伴有心搏驟停幸存史或室速/室顫史的患者即可被診斷為早期復極綜合征(early repolarization syndrome，ERS)。ERS具有明顯的家族遺傳傾向，目前已發現的與ERS有關的離子通道異常基因有：KCNJ8、CACNA1C、CACNB2b、CACNA2D1、ABCC9、SCN5A、SCN10A和KCND3[9-15]。但目前僅對一小部分已識別的突變進行了功能表達的研究，確定了這些突變與ERS的因果關系及較為合理的致病機制。本研究利用二代測序技術、全細胞膜片鉗、共聚焦熒光顯微鏡等實驗技術，探究CACNA1C-P817S突變與ERS的因果關系及其可能的致病機制。

1 材料和方法

1.1 病例收集與遺傳學分析

本研究遵循赫爾辛基宣言和本單位倫理學規章制度，患者簽署知情同意書。收集就診于武漢大學人民醫院心血管內科的ERS患者，入選標準：心電圖下壁和/或側壁導聯記錄到ERP，并伴有心搏驟停幸存史或室速/室顫史者；ERP：除外V1～V3導聯，12導聯心電圖上≥2個相鄰導聯出現J波(QRS波群終末切跡或頓挫)頂點(Jp)振幅≥0.1 mV，QRS波群時限(在無切跡或頓挫的導聯上)<120 ms，伴或不伴ST段抬高[1-2]。排除標準：所有患者需排除ST段抬高心肌梗死、心室動脈瘤、心包疾病、電解質紊亂(高鉀和低鈣等)、體溫過低、致心律失常型右心室心肌病等其他原因導致的ST段異常抬高。臨床評估包括：病史、詳細的體格檢查、血液檢查、心電圖、超聲心動圖和冠狀動脈造影。收集其外周血樣本，從外周血白細胞中提取DNA，采用二代測序技術，對常見致心肌早期復極的候選基因(KCNJ8、CACNA1C、CACNB2b、CACNA2D1、ABCC9、SCN5A、SCN10A和KCND3)進行測序。這些候選基因的確定是基于既往報道的致ERS的突變基因。PCR擴增候選基因的外顯子及外顯子與內含子的接頭序列，將純化的PCR產物于ABI 3730遺傳分析儀(Applied Biosystem，美國)上進行循環測序，測序結果由Mutation Surveyor V4.0.8軟件(Softgenetics，美國)進行分析，并重復以上程序再次確認。被認為具有致病性的新突變為：(1)終止/移碼突變；(2)錯義突變位于物種間氨基酸保守區域；(3)符合GT-AT法則的剪切位點突變；(4)對照人群中最小等位基因頻率(MAF)<0.005；和/或(5)通過PolyPhen-2和MetaLR軟件預測可能有害或致病的突變。

1.2 HEK細胞的轉染

將野生型(WT)和攜帶突變的CACNA1C全長cDNA序列克隆于帶有增強型黃色熒光蛋白(EYFP)的pcDNA3.1載體，構建相應質粒。同時將WT-CACNB2b和CACNA2D1全長cDNA序列克隆于pcDNA3.1載體，構建WT-CACNB2b和WT-CACNA2D1質粒。將3種質粒按1∶1∶1的比例，按照Lipofectamine 2000說明書用Lipofectamine 2000轉染試劑(Life Technologies，美國)共轉染入人胚腎293(HEK293)細胞(中科院上海細胞庫，中國)。

1.3 細胞電生理檢測

選取轉染后48～72 h，在倒置熒光顯微鏡(IX70，Olympus，日本)下觀察，為單個獨立、表面光滑、形態良好且貼壁牢固的帶有黃色熒光的細胞，置于配置好的細胞外液中(MgCl21 mmol/L、CaCl22 mmol/L、HEPES 10 mmol/L、葡萄糖10 mmol/L、TEA 150 mmol/L，CsOH調節pH至7.35)。全細胞膜片鉗系統使用AXON-700B膜片鉗放大器(Axon Instruments，美國)來記錄ICa，全過程在室溫(20～23 ℃)下進行。連接膜片鉗放大器與計算機，由pCLAMP 10.4軟件(Axon Instruments，美國)控制，Digidata 1440A數模轉換器(Axon Instruments，美國)采集信號。玻璃微電極充灌電極內液后(CsCl 110 mmol/L、CaCl20.1 mmol/L、EGTA 10 mmol/L、HEPES 10 mmol/L、Mg-ATP 2 mmol/L、TEA 10 mmol/L，CsOH調節pH至7.35)，對選取的細胞進行負壓封接和破膜，形成全細胞記錄模式，記錄ICa。補充細胞膜電容，串聯電阻自動進行補償70%～80%。保持電位為-90 mV，命令電位依次為-60～+60 mV，測試脈沖400 ms，步階10 mV，在以脈沖電壓為橫軸，電流密度(電流值/細胞膜電容)為縱軸，繪制電流-電壓(I-V)曲線。保持電位為-90 mV，命令電位依次為-60～+60 mV，測試脈沖400 ms，步階10 mV，以脈沖電壓為橫軸，G/Gmax為縱軸[G=Itp/(Vm-VR)]，繪制電壓依賴的穩態激活(steady-state activation，SSA)曲線，采用Boltzmann方程對SSA曲線進行擬合：G/Gmax=1+exp[(Vm-V1/2)/k]。保持電位為-90 mV，命令電位依次為-100～+20 mV，測試脈沖400 ms，步階10 mV，以脈沖電壓為橫軸，I/Imax為縱軸，繪制電壓依賴的穩態失活(steady-state inactivation，SSI)曲線，采用Boltzmann方程對SSI曲線進行擬合：I/Imax=1+exp[(Vm-V1/2)/k]。G為全細胞通道激活電導，Gmax為全細胞通道最大激活電導，Itp為不同電壓下全細胞峰值電流，VR為通道的反轉電位，Imax為電流最大值，Vm為去極化脈沖電壓，V1/2為半激活/半失活電壓，k為斜率因子。

1.4 共聚焦熒光顯微鏡檢測

選取轉染后48 h的帶有pEYFP黃色熒光的HEK293細胞，放在共聚焦熒光顯微鏡(TCS SP8，Leica Microsystems，德國)下采集熒光圖像。在XYZ三維層面上檢測分析EYFP標記的細胞，限定細胞膜2 μm區域為外周染色，分別測量外周和細胞整體平均熒光強度，并計算外周與整體平均熒光強度的比值，測量結果直接用測量得到的平均熒光強度進行比較，未標準化為細胞面積后的值進行比較。圖片使用Image-Pro Plus圖像分析軟件分析平均熒光強度。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 臨床資料分析

先證者是1例20歲男性青年，兩次運動過程中發生暈厥史。常規心電圖提示(如圖1)：竇性心動過緩(HR=46次/min)，QRS=98 ms，QTc=367 ms，Ⅱ、Ⅲ、aVF、V2～V6導聯J波抬高均≥0.1 mV，其中Ⅱ、Ⅲ和aVF導聯抬高≥0.2 mV，V2～V5導聯可見ST段呈上斜型抬高，排除了引起ST段異常抬高的其他可能原因，包括急性心肌梗死和心室動脈瘤等。體格檢查未發現異常；超聲檢查提示右房和右室輕度擴大，左室和右室射血分數均正常；既往無心搏驟停史，否認ERS和心源性猝死家族史。

2.2 遺傳學分析

該ERS先證者致病基因為編碼L型鈣離子通道(LTCC)的α1亞單位CACNA1C，為錯義突變，且位于氨基酸保守區域。突變位于17號外顯子上核苷酸2449區，胞嘧啶C突變成胸腺嘧啶T(c.2449 C>T)，使脯氨酸(P)被絲氨酸(S)所替代(P817S)，Cav1.2的DⅡ/Ⅲ結構域。MAF為0.002，PolyPhen-2(評分為0.997)、MetaLR軟件(評分為0.839)預測可能為有害突變。

圖1 ERS先證者常規心電圖(25 mm/s，10 mm/mV)

2.3 細胞電生理檢測

2.3.1CACNA1C-P817S突變對I-V曲線的影響

如圖2，P817S組ICa密度較WT組顯著降低，在0 mV時峰電流密度降低了約68.8%，從(-19.2±1.5)pA/pF降至(-6.0±1.7)pA/pF。

2.3.2CACNA1C-P817S突變對ICaSSA曲線的影響

如圖3A-C，兩組SSA曲線無明顯差異，半激活電壓V1/2分別為WT組(11.3±1.5)mV和P817S組(12.5±1.5)mV，SSA曲線斜率k也無明顯改變(WT vs P817S：6.3±1.0 vs 6.5±1.3，P>0.05)。

2.3.3CACNA1C-P817S突變對ICaSSI曲線的影響

如圖3D-F，P817S突變使半失活電壓V1/2明顯減小，V1/2由(-30.4±0.75) mV變為(-41.6±0.84) mV，但失活曲線斜率k保持不變(WT vs P817S：7.4 ± 1.1 vs 6.5 ± 1.3，P>0.05)。提示CACNA1C-P817S突變加速了LTCC的穩態失活。

2.4 轉運功能研究

與WT組相比，P817S組Cav1.2蛋白外周熒光強度的絕對值明顯降低[WT vs P817S：(19.6±2.0)MD vs (12.2±1.9)MD，P<0.01]，如圖3C。P817S組Cav1.2蛋白外周/整體熒光強度的百分比也較WT組降低(WT vs P817S：(30.2±2.3)% vs (20.9±2.2)%，P<0.01，n=4)，如圖3D,提示P817S突變組細胞Cav1.2蛋白轉運功能降低。

3 討論

離子通道疾病是年齡<30歲人群中心源性猝死的主要原因，而基因和分子是這類疾病的決定性因素[16-17]。ERS作為離子通道疾病的一種，如前所述，其心電圖表現即ERP一直被認為是一種良性表現，一直到2008年，Ha?ssaguerre等[4]的開創性研究發現ERS與惡性心律失常及心源性猝死相關。2013年，ERS在《2013 HRS/EHRA/APHRS遺傳性心律失常綜合征診治專家共識》中首次作為一種獨立的遺傳心律失常被提出[18]。目前發現與ERS相關的離子通道有3種(IK-ATP、ICa-L和INa)，相關的基因突變有KCNJ8、CACNA1C、CACNB2b、CACNA2D1、ABCC9、SCN5A、SCN10A和KCND3。但目前僅對一小部分已識別的突變進行了功能表達的研究，確定了這些突變與ERS的因果關系以及較為合理的致病機制。因此，對基因突變的功能性和生物學驗證是基因檢測結果解讀的環節。本研究通過對CACNA1C-P817S突變進行了相應的功能性和生物學研究，探究CACNA1C-P817S突變與ERS的因果關系及其可能的致病機制。

注：A和B為兩組細胞ICa原始電流曲線記錄圖；C為兩組細胞的I-V曲線，每個點的值為為在0 mV時記錄的兩組ICa峰電流密度的比較。***表示P<0.001(WT vs P817S)。圖2 CACNA1C-P817S突變對ICa的影響

注：A表示WT和P817S突變的SSA曲線；B為兩組SSA曲線半激活電壓V1/2的比較；C為兩組SSA曲線斜率因子k的比較；D表示WT和P817S突變的SSI曲線；E為兩組SSI曲線半失活電壓V1/2的比較；F為兩組SSI曲線斜率因子k的比較。***表示P<0.001，NS表示無統計學差異(WT vs P817S)。圖3 CACNA1C-P817S突變對SSA曲線和SSI曲線的影響

注：圖A和B分別表示兩組轉染細胞熒光染色圖像，黃色熒光顯色部分代表Cav1.2蛋白；圖C表示兩組細胞Cav1.2蛋白外周熒光強度的絕對值比較；圖D表示兩組細胞Cav1.2蛋白外周/整體熒光強度百分比的比較。**表示P<0.01(WT vs P817S)。圖4 共聚焦熒光顯微鏡下HEK293細胞Cav1.2蛋白轉運功能的比較

ERS的電生理機制一直存在爭議，但近來Koncz等[19]的ERS實驗模型為復極化假說提供了證據：Ito是引起1期快速復極的主要跨膜電流，相對于心內膜，心外膜有更多的Ito通道；正常情況下，心外膜動作電位1相外向電流強于心內膜，因此心外膜在動作電位1相時表現為更為明顯的切跡，而心內膜動作電位尖峰通常較細小，形成跨室壁的電壓梯度，ERS患者跨室壁電壓梯度會增大，進而出現J點抬高、明顯J波或QRS波群終末的頓挫；心動過緩時，迷走神經張力增加，可使IK-ATP激活，導致心室Ito增強，誘發心動過緩相關性J波；而睪酮在增強IKs的同時抑制ICa，使外向電流明顯增強，J波振幅增高[20-22]。因此ERS多見于男性青壯年，同時也有研究表明心動過緩和長間歇可使J波和ST段抬高更加明顯[23-24]。此外，LTCC基因突變可使ERS患者QT間期相對縮短[10]。本研究ERS先證者為一男性青年，臨床特征與既往研究相符；既往無心搏驟停史，也否認ERS和心源性猝死家族史，但常規心電圖可見多個導聯J波抬高≥0.1 mV，甚至所有下壁和側壁導聯V4均≥0.2 mV，同時多個導聯可見ST段抬高，考慮可能為心動過緩相關性J波；先證者暈厥發生在運動過程中，而ERP又出現在心動過緩時，考慮可能是運動后恢復期迷走神經介導，類似于心動過緩性J波。Rosso等[6]發現，心電圖存在J波的人群出現室顫的概率為11/10萬，因此ERS的高度危險性引起了關注，早期篩查高危ERS人群尤為重要。ERS高危因素有：(1)家族人群中存在ERS，且具有不明原因的暈厥及猝死者；(2)可能出現過因室速或室顫導致的暈厥或心臟事件；(3)當QRS波群終末部分出現頓挫，且J波明顯抬高伴隨T波倒置；(4)左室下壁、下側壁或所有導聯均出現J波或ST段抬高≥0.2 mV；(5)運動后恢復期迷走神經介導的ST段抬高也預示著惡性改變等[1，25]。先證者下壁導聯J波抬高均≥0.2 mV，同時又可能是運動后恢復期迷走神經介導，故先證者屬于高危ERS，可能有更高發生惡性心律失常的風險，需隨訪來進一步研究。先證者QTc為367 ms，相對較短，推測為LTCC基因突變的可能性較大。通過二代測序技術，證實確為編碼LTCC α1亞單位CACNA1C發生了錯義突變，c.2449 C>T/p.P817S，MAF為0.002，PolyPhen-2和MetaLR軟件預測為有害突變。

LTCC有CaV1.1、CaV1.2、CaV1.3和CaV1.4四種亞型，心肌細胞主要表達CaV1.2亞型，由α1、β2、α2δ和/或γ亞基四種亞基組成。α1亞基的編碼基因是位于12號染色體上的CACNA1C，為離子轉運孔道，也是LTCC功能和藥理學特性的決定性蛋白，但LTCC功能表達需β2和α2δ亞基的輔助，以提高細胞膜表達密度，順應細胞內信使調控[10，26]。CACNA1C突變可導致長Q-T間期綜合征、Brugada綜合征、ERS以及短Q-T間期綜合征。但在既往研究報道中，功能性缺失較少見。Cav1.2羧基末端的突變可能對Cav1.2功能表達和蛋白表達水平有明顯作用，心臟疾病相關CACNA1C基因突變在Cav1.2多見于羧基末端，且該區域的突變多產生功能喪失性效應，而發生在跨膜區域的突變較為少見[10，27]。ICa大小不僅和離子通道活性有關，還與細胞膜上的通道數量有關，這取決于Cav1.2蛋白的轉運功能。Antzelevitch等[28]發現CACNA1C-A39V突變導致的ICa功能性缺失是由于該突變降低了Cav1.2蛋白的轉運功能。如前所述，睪酮在增強IKs的同時抑制ICa，使外向電流明顯增強，J波振幅增高。先證者為一男性青年，致病突變又為LTCC基因突變，理論上，睪酮和CACNA1C突變的雙重作用，會使臨床癥狀更明顯和更嚴重，但目前癥狀表明并沒有，可能是因為存在個人易感性的可能，當然，這也在一定程度上提示了該先證者有癥狀惡化的可能，需密切注意。既往研究發現，CACNA1C突變可使ICa功能缺失，從而表現為ERS[10]。本研究通過全細胞膜片鉗技術對CACNA1C-P817S進行功能學研究，結果顯示P817S突變可降低ICa密度，加速LTCC的失活，但并未改變激活。為進一步研究ICa密度的降低是否是Cav1.2蛋白轉運功能降低所致，本研究通過共聚焦熒光顯微鏡技術，通過對Cav1.2蛋白轉運功能進行分析，發現P817S突變可使Cav1.2蛋白轉運功能降低，于是可對細胞電生理結果中P817S突變組中ICa密度的降低作出較為合理的解釋：P817S突變通過降低Cav1.2蛋白的轉運功能，使細胞膜上有效Cav1.2蛋白數量減少，從而降低了ICa的密度。

綜上，本研究通過對ERS先證者進行基因篩查，發現一個新的基因突變CACNA1C-P817S，通過功能分析證實為功能缺失性突變，該突變通過降低Cav1.2蛋白的轉運功能，使細胞膜上有效Cav1.2蛋白數量減少，從而降低了ICa的密度。本研究結果提示，CACNA1C-P817S突變為ERS的一個致病基因，明確ERS的分子遺傳學和功能學基礎可為其診斷和治療提供一定的依據。

4 限制與不足

本研究的局限性是缺乏來自先證者的誘導性多能干細胞衍生的心肌細胞以及進一步的體內研究，而這對于解釋復雜遺傳變異的累積效應是優選。另一局限性是，本研究缺乏蛋白定量相關的研究，這可能在部分程度上對試驗結果造成偏倚。