矽肺大鼠肺組織差異蛋白篩選與質譜分析

劉素娜，郝長付，暴 磊，趙德華，王麗雯，姚 武

1)鄭州大學第三附屬醫院新生兒疾病篩查科 鄭州 450052 2)鄭州大學公共衛生學院勞動衛生與職業病學教研室 鄭州 450001 3)河北醫科大學公共衛生學院勞動衛生與環境衛生學教研室 石家莊 050017

矽肺是由于長期低濃度吸入游離二氧化硅(SiO2)粉塵引起的以肺間質炎癥和彌漫性纖維化為主的全身性疾病[1]。目前矽肺的發病機制尚不完全清楚，沒有早期診斷的特異性生物標志物，也沒有逆轉肺纖維化的治療藥物和方法，因而矽肺仍未得到有效控制，其防控形勢依然嚴峻[2]。有研究[3]證實，矽肺纖維化過程中有許多生長因子、炎癥細胞因子等蛋白質和活性氧(reactive oxygen species，ROS)的參與。SiO2暴露會引起機體內環境穩態的變化，也必然會引起肺組織中多種蛋白質或小分子物質表達水平的改變，這是矽肺肺組織差異蛋白質組學研究的理論基礎。以往對蛋白質的研究檢測方法有Western blot、免疫組化、ELISA等，常常只能知道一種或幾種蛋白質的表達情況，而應用差異蛋白質組學則可以得到兩種樣品中所有蛋白質表達情況的差別，可以整體、綜合、全面地反映在特定情形、特定時段樣品蛋白質組的情況。

課題組前期研究[4]發現，在3周內細胞性結節形成的炎性反應期，大鼠肺組織中細胞因子IFN-γ和IL-18表達均顯著增高。本研究擬采用差異蛋白質組學中經典的雙向電泳技術，再聯合基質輔助激光解吸電離飛行時間串聯質譜(MALDI-TOF-MS)進行質譜鑒定，篩選SiO2暴露3周大鼠矽肺早期炎癥反應期肺組織中的差異蛋白，建立矽肺差異蛋白圖譜，并利用Western blot技術挑選差異蛋白進行鑒定，為尋找早期矽肺炎癥可能的干預生物標志物、探索矽肺發病機制提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1實驗動物SPF 級 SD 大鼠20只，雄性，180～220 g，6～8 周齡，購自河南省實驗動物中心[許可證號SCXK(豫)2010-0002]。采用隨機數字表法將20只大鼠隨機分為對照組和模型組(每組10只)。

1.2主要實驗試劑與儀器游離SiO2標準品(粒徑在1～5 μm的>80%)購自美國Sigma公司，24 cm pH 3～10線形IPG膠條、Bio-lyte3/10兩性電解質均購自GE Healthcare公司，抗組蛋白H2B1型(H2B1)抗體、鈣網蛋白(calreticulin,CRT)抗體和GAPDH 抗體購自美國Abcam公司，免疫組化試劑盒、辣根過氧化物酶標記的抗兔或抗小鼠IgG抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司，PVDF膜購自美國Millipore公司，RIPA組織蛋白裂解液、ECL化學發光試劑、SDS-PAGE配制試劑盒購自武漢碧云天生物技術研究所，DYY-6C型垂直電泳儀購自北京六一儀器廠，IPGphor等電聚焦儀、Ettan DALT Ⅱ垂直電泳儀購自Amersham Biosciences公司，5800 MALDI TOF/TOF基質輔助激光解吸電離飛行時間串聯質譜儀購自美國AB公司，凝膠圖像掃描儀、Image Master 2D Platinum 6.0購自GE Healthcare公司，Centrifuge 5424 R離心機購自Eppendorf公司。

1.3大鼠矽肺模型的建立采用吸入式氣管滴注法建立大鼠矽肺模型[5-6]。將游離SiO2標準品研磨，180 ℃干燥4 h，恒重，用滅菌生理鹽水配成100 g/L的SiO2懸液。高壓蒸汽滅菌后4 ℃冰箱保存，染塵前加2 000 U/mL青霉素。采用異氟烷大鼠自主吸入麻醉法麻醉大鼠，之后大鼠牙齒勾住細繩懸掛于造模染塵架上，用強光手電筒照射頸部氣管，從空腔看到一張一合的氣管口時用中號無頭圓鈍灌胃針進行氣管內插管。插管成功后快速將1 mL的SiO2懸液推入氣管，再向氣管內推入2 mL空氣，迅速拔管，以盡快解除窒息。對照組以含等量青霉素的無菌生理鹽水1 mL代替SiO2懸液，以同樣方法向大鼠氣管內滴注。1次/d，共染塵3次。于染塵 3 周后處死大鼠。

1.4肺組織HE染色處死大鼠后，取左肺中部約1 cm×1 cm大小的肺組織塊，生理鹽水沖洗2遍后立即置于體積分數10%的中性甲醛中固定；經常規石蠟包埋后進行切片(片厚3 μm)、HE染色，剩余肺組織-80 ℃保存備用。

1.5肺組織蛋白的提取取肺組織100 mg，用眼科剪剪碎后放進研磨勻漿器中，加1 mL蛋白裂解液置冰上研磨，使蛋白充分裂解；將組織勻漿液轉移入新的EP管中，冰浴超聲(400 W，工作時間10 s；間隔10 s，共20次)進一步破碎組織細胞，然后4 ℃離心，12 000×g，30 min；吸取上清，4 ℃離心，12 000×g，20 min；吸取上清，4 ℃離心，12 000×g，10 min，取上清液，用Bradford法測定蛋白質濃度后分裝，-80 ℃保存備用。

1.6雙向電泳將同組大鼠的蛋白質樣品等量混勻，取700 μg，加水化上樣緩沖液使總體積至450 μL，加入2.5 μg Bio-lyte3/10兩性電解質和4 mg DTT混勻，置IPGphor等電聚焦儀進行等電聚焦。等電聚焦程序：30 V，12 h；100 V，1 h；1 000 V，1 h；8 000 V，2 h；8 000 V，55 000 Vh；500 V，5 h。等電聚焦工作溫度為20 ℃，每根膠條電流50 μA。等電聚焦結束取出膠條平衡后，移至120 g/L分離膠中進行垂直電泳。每組3次。

1.7二維凝膠電泳(two-dimensionalgelelectrophoresis,2-DE)凝膠圖像掃描與質譜分析雙向電泳結束后，用考馬斯亮藍染色液對凝膠進行染色，然后用凝膠圖像掃描儀采用800 ppi分辨率對染色后的凝膠進行掃描，應用Image Master 2D Platinum 6.0對雙向電泳圖譜進行分析。標記、挖取差異蛋白點，送生工生物工程(上海)股份有限公司，采用5800 MALDI TOF/TOF基質輔助激光解吸電離飛行時間串聯質譜儀進行串聯質譜分析，得到每個樣品各個肽段的質荷比(M/Z)測定數據，使用Mascot軟件，在NCBInr數據庫中搜索理論上能與肽段相匹配的蛋白。綜合分析蛋白數據庫搜索結果、相對分子質量、實際等電點(actual isoelectric point，PI)和得分等因素，對蛋白進行最終鑒定。

1.8肺組織中差異蛋白的Westernblot分析本實驗參考文獻[7]，應用Western blot檢測篩選的評分最高和評分最低的差異蛋白在大鼠肺組織中的表達情況。Bradford法測定蛋白質濃度后，調節蛋白濃度，用100 g/L SDS-PAGE分離蛋白，PVDF轉膜。50 g/L脫脂奶粉液室溫封閉1 h，加一抗4 ℃孵育過夜。TBST洗3遍，辣根過氧化物酶標記的二抗37 ℃孵育30 min，化學發光法顯影。采用Image J圖像分析軟件測定條帶灰度值。

1.9統計學處理采用SPSS 21.0對實驗數據進行分析，應用兩獨立樣本t檢驗比較對照組和模型組大鼠肺組織中CRT和H2B1蛋白表達的差異。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1大鼠矽肺模型的鑒定染塵3周后，肉眼觀察對照組大鼠肺組織粉紅色，質軟，表面光滑；模型組大鼠雙肺體積增大，局部充血、腫脹，表面均勻分布直徑1 mm 左右的灰白色小結節，灰白色結節不規則狀突出于肺表面(圖1)。HE染色顯示對照組肺組織結構正常，肺泡結構清晰；模型組大鼠肺組織出現典型的細胞性結節改變，矽結節數量增多且體積增大，肺組織結構有破壞(圖2)。

圖1 2組大鼠肺組織標本肉眼觀

黑色箭頭指示細胞性結節

2.2雙向電泳與圖像分析結果雙向電泳圖譜見圖3。分別對染色后的蛋白點進行匹配，染色匹配率為77%，效果均較好。

圖3 2組大鼠肺組織總蛋白雙向電泳圖譜

2.3差異蛋白點MALDI-TOF-MS肽質量指紋圖譜鑒定與分析結果對雙向電泳圖譜進行分析，共獲得274組蛋白點信息，經過綜合對比分析，篩選出15個差異蛋白點。采用一級和二級質譜相結合的方法對15個差異蛋白點進行鑒定，14個蛋白點獲得14張良好的肽質量指紋圖譜，碰撞碎裂后的母離子肽段均獲得了較為豐富的碎片信息，指紋圖譜峰信號強，質量高。第10號蛋白肽指紋圖譜片段峰主要位于1 000～2 500 M/Z區間(圖4)。經與NCBInr蛋白數據庫查詢比對，其中6個差異蛋白點在數據庫中匹配到有意義的蛋白，這6種蛋白分別為原肌球蛋白2(tropomyosin-2，TMP2)、CRT、碳酸酐酶3(carbonic anhydrase 3，CAH3)、H2B1、肌酸激酶M(creatine kinase M chain，CRM)、肌球蛋白調節性輕鏈(myosin regulatory light chain 2，MLC2)，其中TPM2、CRT和CAH3在矽肺大鼠肺組織中表達下調；H2B1、CRM和MLC2表達上調。結果見表1。

圖4 2組大鼠肺組織雙向電泳圖譜中10號蛋白肽指紋圖譜

表1 差異蛋白質鑒定結果

2.4Westernblot蛋白分析結果見圖5。由圖5可知，與對照組相比，差異蛋白評分最高的CRT在大鼠矽肺模型表達降低(t=5.132，P<0.001)，評分最低的H2B1表達增高(t=2.145，P=0.017)。

圖5 2組大鼠肺組織中CRT和H2B1蛋白表達的比較

3 討論

本研究采用吸入式氣管滴注法成功建立大鼠矽肺模型，HE染色結果顯示，染塵3周后模型組大鼠肺組織有較大的炎性結節形成。利用雙向電泳和質譜分析技術，通過對2組大鼠肺組織蛋白點的對比分析，找出了15組差異蛋白。雙向電泳獲得了較為清晰的圖譜；每組進行3次染色，匹配效果均較好。這些都說明本實驗有較好的重復性和可靠性。

TMP2屬于原肌球蛋白(tropomyosin,TM)的一個亞型，是廣泛分布于真核生物中的一種細胞骨架蛋白，哺乳動物中存在TM1、TM2、TM3和TM4 4個異構體[8]。有研究[9]證實在大鼠肝纖維化模型組TMP2表達增強，提示其可能參與了肝纖維化的發生和發展過程。CRT是廣泛存在于各種真核生物細胞中的多功能調節蛋白，能夠維持細胞內的鈣穩態，具有分子伴侶、細胞黏附和基因表達調控等多種生物學功能[10]。Lu等[11]研究發現糖尿病小鼠腎臟CRT表達增加，其在糖尿病性腎病腎纖維化的發展中起重要作用。本研究結果顯示CRT在矽肺大鼠肺組織中表達降低，可能與矽肺前期炎性細胞和細胞因子動態失衡有關。CAH3是一種細胞質酶，參與了機體線粒體ATP的合成、自身免疫、氧化應激反應等多項重要的生理過程[12]。Staunton等[13]研究發現CAH3水平隨肌肉老化逐漸增加，增高的CAH3水平提示人類在衰老的過程中肌纖維逐漸向慢性收縮性纖維轉化。H2B1是組蛋白H2B的一個亞型，對染色體的結構有重要作用；H2B在損傷位點的單泛素化可能對DNA雙鏈的斷裂修復具有重要作用[14]。本課題組前期研究[15]通過建立矽肺纖維化體外細胞模型共篩選出1 815個基因存在組蛋白差異。該研究結果顯示H2B1在矽肺大鼠肺組織中表達增高。CRM是肌酸激酶的重要組成部分，對維持機體能量代謝平衡及機體運動過程起重要作用[16]。研究發現血漿中高水平的CRM能夠反映急性心肌梗死預后[17]和作為肌萎縮性側索硬化癥早期出現的指標[18]。Takamori等[19]研究發現肌酸激酶可以作為一種新穎的生物標志來監測某些腫瘤的預后。MLC2是肌球蛋白的主要調節區域，目前MLC2的進化起源、表達模式和功能了解甚少，有研究[20]發現MLC2基因突變會導致心臟結構缺陷和纖維化。

本課題組前期研究檢測了矽肺模型大鼠外周血和肺泡灌洗液中DC、Th1/Th2細胞和Th1/Th2細胞因子的表達情況[6,21]，結果顯示，矽肺大鼠肺臟中DC和Th1/Th2細胞均存在一個動態變化過程，3周是矽肺發展過程中Th1細胞反應占主導的炎癥反應期(1周、2周)向Th2細胞反應占主導的纖維化期(6周、9周)的過渡時間。姚三巧等[22]研究發現早期煤工塵肺患者血清中表達特異性細胞因子。基于此，本實驗運用雙向電泳聯合質譜技術鑒定大鼠矽肺初期肺組織差異表達蛋白，對獲得的15個差異蛋白點的肽質量指紋圖譜進行數據庫檢索，最終鑒定出6個有意義的蛋白點，應用Western blot檢測了CRT和H2B1蛋白在大鼠矽肺模型中的表達情況，發現CRT 在大鼠矽肺模型中表達降低，H2B1表達增高，差異有統計學意義。

綜上所述，篩選的差異表達蛋白可能在矽肺纖維化發生發展中發揮作用。