無創產前檢測對胎兒染色體拷貝數變異檢測的應用研究

周元圓，翟秀璋，鐘瑩，杜玉芳，秦雪★

（1.廣西醫科大學第一附屬醫院，廣西 南寧；2.南寧市第二人民醫院，廣西 南寧）

0 引言

染色體畸變是指在孕婦懷孕期間，染色體結構或數目的異常，是目前導致新生兒出生缺陷發生的主要原因之一[1]。由于傳統核型技術的限制，對于10 Mb以下的拷貝數變異不易被識別，因此容易出現漏診現象，在這樣的前提下，如何有效提高胎兒染色體CNV的檢測準確率已經成為臨床關注的重點[2]。研究表明，由于高通量技術的迅速發展，NIPT不僅可以用于染色體非整倍性的產前篩查，而且在檢測染色體CNV方面具有良好的應用價值[3]。對此本次研究針對本院NIPT提示存在染色體CNV的59例孕婦進行胎兒染色體拷貝術變異檢測，旨在分析其臨床價值，詳見下文所示。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選取自2018年1月至2020年8月于本院接受NIPT檢測，提示存在染色體拷貝數變異的孕婦作為研究對象，其中59例接受介入性產前診斷。年齡18～48歲，平均（32.0±5.5）歲，孕周 12～34周，平均（17.4±3.1）周；所有孕婦均知情研究并自愿加入研究。結合產前診斷及隨訪結果進行回顧性分析，對NIPT結果進行驗證，評估無創產前檢測對胎兒拷貝數變異檢測的應用價值。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集及血漿分離

采集孕婦外周血10 mL置Streck Cell-free DNA BCT抗凝管。4 ℃條件下以1600 r/min離心15 min，吸取上清血漿轉入2.0 mL低吸附管內，再次以4 ℃條件下16000 r/min離心10 min。吸取上清血漿，分裝至置于冰盒上的2 mL離心管中，每管轉入約400 μL血漿，放置-20 ℃或-80 ℃冰箱中儲存。

1.2.2 無創產前檢測（NIPT）

（1）采用核酸提取試劑盒試劑盒提取DNA,通過晶芯胎兒非整倍體檢測試劑盒（博奧晶典生物技術）對基因組DNA進行文庫構建、文庫定量、油包水PCR，ES富集等操作后，采用Life lon Torrent（Bioelectronseq 400）測序平臺進行檢測。

（2）測序結束后，運用《無創產前數據分析管理軟件》對測序數據進行分析，得到樣本21號染色體、18號染色體和13號染色體的Z值，根據每個樣本的Z值判斷樣本的檢測結果。

1.2.3 拷貝數變異測序檢測（CNV-Seq）

對NIPT提示染色體拷貝數變異的孕婦，行羊膜腔穿刺采集10 mL胎兒羊水，根據染色體異常基因檢測項目的SOP（博奧晶典生物技術）對樣本進行基因組DNA提取（QIAamp提取試劑盒）、測序文庫構建、文庫定量、上機測序等流程。測序采用Life lon Torrent平臺（Bioelectronseq 400）測序系統進行檢測。通過公共數據庫（Decipher、Omim、DGV、ClinGen）對檢測數據進行綜合評判，認定CNV是否有臨床意義。

2 結果

對NIPT提示染色體微小片段缺失、重復的孕婦進行介入性產前診斷，數據顯示，59例NIPT提示CNV的孕婦接受介入性產前診斷，28例經CNV-seq檢測到CNV，其中27例與NIPT結果一致，1例檢測到的CNV結果不一致，NIPT篩查CNV符合率為45.7%（27/59）。28例樣本中，檢測到17例胎兒缺失，位置與NIPT結果提示一致，另有1例胎兒額外檢測到其他缺失片段。檢測到11例染色體微重復，其中10例重復位置與NIPT結果一致，1例不一致，另有2例胎兒額外檢測到其他重復片段。結果一致的27例中，＜5 Mb有11例，≥5 Mb且＜10 Mb有6例，＞10 Mb有10例。結果不一致的1例，片段＜5 Mb。因此，NIPT對≥5 Mb的檢測效能佳，結果基本一致，詳見表1所示。對NIPT提示染色體拷貝數變異孕婦進行隨訪及結果分析，其中發現了1例Angelman/Prader-Willi綜合征、1例貓叫綜合征（Cri du Chat syndrome）及1例22q11微缺失綜合征（22q11 Deletion Syndrome），且NIPT提示的片段大小與CNV結果高度一致。

表1 無創產前技術檢測染色體拷貝數變異的效能（n）

3 討論

染色體拷貝數變異是先天性生長發育遲緩，結構畸形及罕見遺傳綜合征的主要病因。可由病毒感染、化學因子、轉移子、重組酶等異常引起，目前胎兒染色體缺失已經成為新生兒先天性缺陷的主要遺傳因素之一[4]。由于染色體拷貝數變異片段相對更小，在臨床以往常規檢查中不易被發現，多容易出現漏診現象。高通量測序是一種新型的技術測量方式，是在傳統測序的基礎上進行改革后的成果[5]。高通量測序能夠一次性對幾十萬到幾百萬條DNA進行序列測定，針對NIPT提示染色體異常的孕婦進行基因組測序，能夠迅速找到大量的遺傳差異，從而實現遺傳進化分析以及重要性狀候選基因的檢測[6]。此外，高通量測序能夠尋找到大量的結構變異等信息，從而獲取胎兒生物群體的遺傳特征，對胎兒發育現狀做出判斷[7]。在傳統檢測中，由于需要進行穿刺檢查，增加了孕婦流產的風險，而高通量測序檢測能夠通過孕婦外周血液進行胎兒的基因檢測，并具有對較小缺失片段高靈敏度的優勢[8-9]。據多項研究表明，高通量測序能夠檢測出孕婦外周血中的CNV，甚至最小的檢測染色體缺失體積可達到300kb[10-12]。

本次研究針對本院收治療的提示NIPT存在染色體缺失的59例孕婦進行核型分析及染色體拷貝術變異檢測。數據表明，在59例孕婦檢測結果中，28例經CNV-seq檢測到CNV，其中27例與NIPT結果一致，1例檢測到的CNV結果不一致，NIPT篩查CNV符合率為45.7%（27/59）。檢測到17例胎兒缺失，位置與NIPT結果提示一致，另有1例胎兒額外檢測到其他缺失片段。檢測到11例染色體微重復，其中10例重復位置與NIPT結果一致，1例不一致，另有2例胎兒額外檢測到其他重復片段。NIPT對≥ 5Mb的檢測效能佳，結果基本一致。剩余31例胎兒在經由多項檢測后仍舊未發現異常，這可能是由于孕婦機體內的血漿成分較為復雜，因此可能包含了孕婦本身的DNA，所以在對胎兒進行檢測時影響了胎兒的檢測結果，此外測序數據不足等因素也可能導致胎兒檢測結果異常出現；對NIPT提示染色體拷貝數變異孕婦進行隨訪及結果分析，其中發現了1例Angelman/Prader-Willi綜合征、1例貓叫綜合征（Cri du Chat syndrome）及1例22q11微缺失綜合征（22q11 deletion syndrome），且NIPT提示的片段大小與CNV結果高度一致。可見，在胎兒染色體拷貝數變異的檢測中應用無創產前檢測技術，能夠對部分缺失片段較小的DNA進行檢測，避免了以往常規治療中對較小缺失片段漏診現象的出現。在一些典型罕見病的早期發現和診斷起到了重要作用。

在劉學軍等[13]的研究中，對NIPT提示CNV孕婦采取羊膜腔穿刺術，進行染色體核型分析及CNV-seq，在該學者的研究數據中，確診胎兒染色體缺失或重復片段與NIPT檢測結果基本一致，此外，在經由NIPT檢測后另發現較小的缺失片段，分別為2.32 Mb以及6.28 Mb，可見，在染色體缺失或重復胎兒的臨床檢測中，NIPT不僅能對胎兒的非整倍體進行篩查，同時也能對微小片段的缺失和重復進行檢測。然而，由于產前診斷標本中CNV發生率較低，臨床樣本數量有限，仍需要進一步增加研究樣本量，進一步優化檢測效能[14]。

綜上所述，無創產前技術對孕婦胎兒染色體拷貝數變異進行檢測是可行的，可以幫助臨床醫師對胎兒的遺傳咨詢及產前診斷提供依據。對于無法避免的假陽性結果，仍需要依靠產前診斷及超聲隨訪等進行追蹤及遺傳咨詢[15]。但隨著技術的改進和CNV致病性相關數據的積累，NIPT技術有望在產前篩查中發揮更大的作用。