免疫組化檢測乳腺癌組織中RHBDF1、ADAM17和EGFR的表達

李昊鑫，司曉闖，姜涵譯，張雪鵬

（華北理工大學附屬醫(yī)院 腫瘤外科，河北 唐山）

0 引言

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，人類菱形蛋白家族基因 1（Rhomboid Family-1 Gene, RHBDF1）、解聚素 -金屬蛋 白 酶 17（A Disintegrin and Metalloproteinase, ADAM17）和表皮生長因子受體（Epithelial Growth Factor Receptor, EGFR）作為腫瘤標記物在乳腺癌組織表達狀況已見報道[1-2]，但三者同時檢測并且探討其相關(guān)性的研究尚罕見報導。本研究通過免疫組化法觀察RHBDF1、ADAM17和EGFR蛋白在癌旁組織、纖維腺瘤和乳腺癌組織中的表達，分析它們與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系及三者的相關(guān)性，探討三者在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中可能的作用。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選取2019年1月1日至2020年8月31日華北理工大學附屬醫(yī)院病理科存檔的乳腺組織標本。納入標準：①經(jīng)病理診斷為乳腺癌或纖維腺瘤的女性患者；②初次診治且臨床資料完整；③術(shù)前均未接受化療、放療。排除標準：①伴自身免疫性疾病、免疫缺陷病及其他惡性腫瘤者；②遠處轉(zhuǎn)移。根據(jù)納入、排除標準，本研究共納入182例乳腺癌及190例乳腺纖維腺瘤患者。乳腺癌組中，采用隨機抽樣的方法抽取64例乳腺癌，患者年齡 30～77歲，平均（45.54±6.86）歲；乳腺纖維腺瘤組中，采用隨機抽樣的方法抽取30例乳腺纖維腺瘤，患者年齡24～48歲，平均（34.68±9.57）歲。兩組患者年齡比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。另隨機抽樣選取乳腺癌組患者經(jīng)病理學檢查未被浸潤的癌旁組織（腫瘤邊緣＞5 cm區(qū)域）作為癌旁乳腺組（30例）。

1.2 主要試劑

RHBDF1抗體購自Eter Life生物科技公司，ADAM17、EGFR抗體購自武漢三鷹技術(shù)公司，DAB酶底物顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物公司。

1.3 實驗方法

取厚度為4 μm的切片組織進行脫蠟，并應用階梯酒精進行水化、沖洗，后進行抗原修復、消除過氧化物酶活性，再次洗滌切片組織，分別滴加一抗RHBDF1（1:100）、ADAM17（1:100）、EGFR（1:500），4 ℃過夜。次日加二抗（HRP）室溫孵育，并行DAB反應顯色、蘇木素復染，最后封片，于顯微鏡下判讀結(jié)果。

1.4 免疫組化結(jié)果判定

顯微鏡下RHBDF1、ADAM17、EGFR陽性表達在細胞質(zhì)中為棕色顆粒狀。低倍鏡觀察細胞染色分布情況，高倍鏡觀察細胞形態(tài)及染色定位，由2位經(jīng)驗豐富的病理學高年資醫(yī)生采取雙盲法在400倍鏡下隨機選擇5個不重復的視野，記錄陽性細胞數(shù)并取平均值，陽性細胞比例評分：全部陰性為0分，陽性細胞≤10%（1分），10%＜陽性細胞≤50%（2分），50%＜陽性細胞≤75%（3分），陽性細胞＞75%（4分）。根據(jù)細胞染色強度判斷：無著色則為陰性（0分），淡黃色為弱陽性（1分），棕黃色為陽性（2分），棕褐色為強陽性（3分）。統(tǒng)計分析時根據(jù)二者相乘判定結(jié)果：陰性≤1分、陽性＞1分。

1.5 統(tǒng)計學分析

應用SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件中，計量資料采用t檢驗，計數(shù)資料采用卡方檢，相關(guān)性檢驗采用Spearman等級相關(guān)分析，檢驗水準α=0.01，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 RHBDF1、ADAM17、EGFR蛋白在不同乳腺組織中的表達

免疫組織結(jié)果顯示：RHBDF1在癌旁組織、纖維腺瘤、乳腺癌組織中陽性表達率分別為13.3%（4/30）、23.3%（7/30）、82.8%（53/64）；ADAM17在癌旁組織、纖維腺瘤、乳腺癌組織中陽性表達率分別為 10.0%（3/30）、20.0（6/30）、76.6%（49/64）；EGFR在癌旁組織、纖維腺瘤、乳腺癌組織中陽性表達率分別為 13.3%（4/30）、16.7%（5/30）、79.7%（51/64）。乳腺癌組織中RHBDF1、ADAM17、EGFR陽性表達率顯著高于纖維腺瘤及癌旁組織，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖1。

圖1 RHBDF1、ADAM17、EGFR在癌旁組織、纖維腺瘤和乳腺癌中表達的免疫組化檢測（SP×400）

2.2 乳腺癌組織中RHBDF1、ADAM17、EGFR蛋白的表達與臨床病理特征的關(guān)系

結(jié)果顯示乳腺癌組織中RHBDF1、ADAM17、EGFR蛋白的表達陽性率與乳腺癌病理類型、組織學分級均有相關(guān)關(guān)系（P＜0.05），而與患者年齡、臨床分期、ER、PR受體等無明顯相關(guān)性（P＞0.05），見表1。

2.3 乳腺癌組織中RHBDF1、ADAM17、EGFR蛋白表達的相關(guān)關(guān)系

乳腺癌標本中，RHBDF1、ADAM17、EGFR蛋白的表達同為陽性的有48例，共同陰性的有8例，RHBDF1與ADAM17的相關(guān)系數(shù)r=0.712，P=0.000；RHBDF1與 EGFR的相關(guān)系數(shù)r=0.751，P=0.000；ADAM17與EGFR的相關(guān)系數(shù)r=0.785，P=0.000；表明 RHBDF1、ADAM17、EGFR 的蛋白表達具有相關(guān)性，見表2。

3 討論

乳腺癌是發(fā)生在乳腺上皮組織的惡性腫瘤，病因復雜，多認為與基因突變等因素相關(guān)，具有較高的發(fā)病率。在本研究中我們通過對人乳腺癌旁組織、纖維腺瘤、乳腺癌中RHBDF1、ADAM17、EGFR蛋白表達水平進行檢測，發(fā)現(xiàn)從癌旁組織到纖維腺瘤和乳腺癌，RHBDF1、ADAM17、EGFR蛋白表達的陽性率均呈逐漸升高趨勢，并且在乳腺癌中的表達顯著高于癌旁組織和纖維腺瘤，提示乳腺癌的發(fā)生可能與RHBDF1、ADAM17、EGFR蛋白的高表達有關(guān)。此外還發(fā)現(xiàn)，乳腺癌中RHBDF1、ADAM17、EGFR蛋白表達水平與病理類型、組織學分級有顯著的相關(guān)性，進一步提示一定程度高表達的RHBDF1、ADAM17、EGFR蛋白可能加劇了乳腺癌浸潤，預后不良。

表1 RHBDF1、ADAM17、EGFR的表達與乳腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系（n）

表2 RHBDF1、ADAM17和EGFR蛋白表達的Spearman相關(guān)性分析

RHBDF1是缺乏蛋白酶活性的菱形家族的成員，它參與生長信號轉(zhuǎn)導的調(diào)節(jié)蛋白，研究發(fā)現(xiàn)RHBDF1在結(jié)直腸癌、食道癌以及宮頸癌等惡性腫瘤中，RHBDF1基因存在著過度表達，沉默RHBDF1基因表達后，可以誘導細胞發(fā)生凋亡以及抑制細胞生長[3-4]。有研究證明，RHBDF1蛋白在乳腺癌中高表達，但在正常的乳腺組織中幾乎不存在或以低水平存在，在侵襲性導管癌的臨床標本中，RHBDF1 mRNA水平顯著升高，并且在許多人類乳腺癌細胞系中蛋白質(zhì)水平更高，而RHBDF1基因沉默會導致乳腺癌細胞的凋亡或自噬，并抑制腫瘤的生長[5-6]。RHBDF1調(diào)控著ADAM17的成熟和功能,而且也是激活EGFR所需的運輸機制的關(guān)鍵要素,而ADAM17也是EGFR信號傳導的關(guān)節(jié)調(diào)節(jié)劑[7-8]。