非小細胞肺癌中ERCC1與PD-1的表達及其臨床意義

滕華，李影，何嚴璐琦，張洪珍

（1.華北理工大學附屬河北省人民醫院，河北 石家莊 050051；2.河北北方學院附屬河北省人民醫院，河北 石家莊 050051；3.河北省人民醫院腫瘤五科，河北 石家莊 050051）

0 引言

肺癌是目前全球范圍內常見惡性腫瘤之一，成為腫瘤相關死亡的重要原因[1]。在我國，肺癌的發病率和死亡率均處于惡性腫瘤前列[2]。肺癌中大約85%是非小細胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer，NSCLC)，傳統意義上，手術提供了最好的治愈機會，但不幸的是，切除率常低至25%-30%[3]。超過60%的肺癌患者在診斷時就已經處于局部晚期或出現遠處轉移，此時無手術切除的可能，化療和放療則成為肺癌患者的主要治療手段[4]，但傳統的放化療治療效果有限，目前臨床治療上需要面對的挑戰依然十分嚴峻。

切除修復交叉互補基因1 (Excision Repair Cross Complementing 1，ERCC1)存在于人染色體19q13.2～13.3, 全長15kb, 包含10個外顯子, 編碼中含有297個氨基酸蛋白質, 其主要功能為參與DNA鏈的切割和損傷修復，與腫瘤的發生發展及預后等密切相關[5]；程序性死亡受體1( Programmed Death-1，PD-1)是一種免疫抑制分子，在T細胞、B細胞、活化的單核細胞等均有表達，當其與相應配體結合后，可產生免疫抑制信號，促進腫瘤的發生和轉移[6]；ERCC1和PD-1廣泛存在于許多惡性腫瘤之中[7,8]。目前在NSCLC關于ERCC1和PD-1的相關性研究較少，本研究主要討論在NSCLC中ERCC1與PD-1的表達情況及相關性，并分析其與患者臨床病理特征之間的聯系及預后關系，進而闡明其對NSCLC發生發展所產生的影響及臨床意義。

1 材料和方法

1.1 材料

收集我院2014年1月至2015年12月經手術切除并由病理科確診的98例NSCLC石蠟標本和30例癌旁正常肺組織(距離腫瘤組織切緣＞5㎝)石蠟標本。所選病例為初治患者，術前未接受抗腫瘤等相關治療，且隨訪資料完整。男性51例，女性47例；年齡38-80歲，中位年齡61歲，其中≤60歲45例，＞60歲53例；腺癌59例，鱗癌39例；低-中分化52例，高分化46例；淋巴結轉移者36例，無淋巴結轉移者62例；根據美國癌癥委員會(AJCC)第八版TNM分期標準進行分期：Ⅰ期34例，Ⅱ期28例，Ⅲ期36例。生存時間規定為手術日期至死亡或末次隨訪時間。隨訪截止日期為2019年12月31日。

1.2 試劑

兔抗PD-1單克隆抗體、鼠抗人ERCC1單克隆抗體均購自美國Abcam公司；SP檢測試劑盒、DAB顯色試劑盒、二抗試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司；其余所需試劑和實驗儀器均由我院病理科提供。

1.3 方法

采用免疫組織化學法檢測ERCC1及PD-1。目標蠟塊切片5μm，經常規脫蠟水化后，進行高溫抗原修復；以3%的過氧化氫溫育20min滅活內源性過氧化物酶；滴加正常血清封閉液，室溫溫育30 min，除去多余液體；滴加一抗(鼠抗人ERCC1單抗、兔抗PD-1單抗)，放置一夜；次日取出，PBS液洗滌3次，每次5 min；滴加生物素化二抗，PBS液洗滌3次，每次5 min；滴加試劑SABC，PBS液洗滌3次，每次5 min；DAB顯色5min；蘇木素復染2min。乙醇脫水，二甲苯透明，吹風機吹干后中性樹脂封片。陰性對照由PBS代替一抗(余操作步驟相同)。

1.4 免疫組化結果判定

1.4.1 PD-1結果判定

評分標準參照文獻[9]標準，細胞膜或者細胞質中出現黃色或者棕黃色顆粒為陽性表達。按腫瘤陽性細胞百分比與細胞顯色強度分別進行記分，采用半定量法進行評價：陽性細胞數分為＜1%計0分，1%～10%計1分，11%～50%計2分，51%～75%計3分，＞75%計4分；顯色強度分為無顯色計0分，淺黃色計1分，黃色計2分，棕黃色計3分。兩項乘積＜3分為陰性，≥3分為陽性。

1.4.2 ERCC1結果判定

評分標準參照文獻[8]標準，陽性細胞數分為無陽性細胞計為0，1%～9%計為0.1，10%～50%計為0.5，＞50%計為1.0。顯色程度分為無顯色計0分，淡黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分。兩項乘積≥2認定為陽性，反之為陰性。

全部切片由我院2名病理科專業人員隨機獨立閱片后，取平均分。

1.5 統計學方法

采用SPSS 22.0統計學軟件進行數據分析。計數資料以n(%)表示，比較采用卡方檢驗。相關性檢驗采用Spearman等級相關。Kaplan-Meier法進行生存分析，Log-Rank法進行預后的單因素分析，多因素生存分析采用Cox風險比例回歸模型。以α=0.05為檢驗標準，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ERCC1和PD-1在NSCLC組織和正常肺組織中的表達

ERCC1在NSCLC組織中的表達低于正常肺組織，差異有統計學意義(P＜0.05)；而PD-1在NSCLC組織中的表達高于正常肺組織，差異有統計學意義(P＜0.05)，詳見表1。

表1 ERCC1、PD-1在肺癌標本和正常組織標本中的陽性表達率[n(%)]

2.2 ERCC1及PD-1的表達與臨床病理的關系ERCC1陽性表達

在TNM分期為Ⅰ期～Ⅱ期的患者中顯著升高，差異有統計學意義(P＜0.05)；PD-1陽性表達在有淋巴結轉移和TNM分期為Ⅲ期的患者中顯著升高，差異有統計學意義(P＜0.05)；二者表達均與性別、年齡、病理類型、分化程度無關(P＞0.05)，詳見表2。

表2 ERCC1及PD-1的表達與臨床病理特征的關系[n(%)]

2.3 ERCC1和PD-1的表達與預后的關系

ERCC1陽性表達組的5年生存率為30.60%，中位生存期為45.0個月；陰性組的5年生存率為14.30%，中位生存期為29.0個月；兩組間生存率的比較差異有統計學意義（χ2=6.013，P=0.014）（圖1）。PD-1陽性表達組的5年生存率為11.10%，中位生存期為28.0個月；陰性組的5年生存率為29.00%，中位生存期為40.0個月；兩組間生存率的比較差異有統計學意（χ2=7.147，P=0.008）（圖2）。

圖1 ERCC1陽性組與陰性組的生存曲線

圖2 PD-1陽性組與陰性組的生存曲線

經Cox多因素分析，結果顯示：僅TNM分期（P=0.011，95%CI:1.203-4.092，RR=2.219）和淋巴結轉移（P=0.043，95%CI:1.020-3.157，RR=1.794）是影響預后的獨立危險因素；ERCC1和PD-1的表達并非預后的獨立危險因素，詳見表3。

表3 影響NSCLC預后Cox多因素分析

2.4 NSCLC組織中ERCC1及PD-1表達的相關性

49例ERCC1陽性表達中，有19例PD-1陽性表達；49例ERCC1陰性表達中，有32例PD-1陰性表達，詳見表4。Spearman等級相關性分析結果顯示，ERCC1和PD-1在NSCLC中的表達無明顯相關性（rs=0.042，P＞0.05）。（表4）

表4 ERCC1及PD-1在NSCLC組織中表達的相關性(n)

3 討論

肺癌作為常見的惡性腫瘤之一，已經嚴重威脅到人類的健康[1,2]。2015年Chen等[2]基于中國惡性腫瘤現狀大數據指出，肺癌是引起男性和女性癌癥死亡的五大原因之一，其中肺癌的發病率占男性惡性腫瘤之首，而在女性惡性腫瘤中僅次于乳腺癌。在科學技術日新月異的年代，肺癌的治療已經進入到個體化治療階段，本研究通過聯合檢測ERCC1和PD-1，企圖從基因環境和免疫微環境兩方面來探討腫瘤的發生與發展，為NSCLC的治療提供參考意義。

ERCC1是核苷酸切除修復過程中的限速酶，也是DNA修復基因家族中的重要成員之一，ERCC1 mRNA的低表達提示核苷酸切除修復能力降低，導致肺癌發病風險增加[10]，高水平表達與順鉑制劑耐藥有關[11]。目前對于ERCC1與臨床病理特征的關系報道尚無定論。Ota S等[12]研究顯示，ERCC1的表達與性別、年齡、吸煙情況、病理分期無關，而與病理類型有關。Deng等[13]報道ERCC1在癌組織和癌旁組織的表達，與性別、年齡、吸煙情況、病理類型無關，與腫瘤TNM分期有關，與本研究結果相近。近年來有關ERCC1與肺癌預后關系的說法不一，多數研究認為NSCLC早期患者，ERCC1是預后良好的指標，其高表達有利于延長生存時間，而晚期患者，ERCC1影響化療導致耐藥，其高表達往往降低生存期[5,8,12,13]。本研究結果提示ERCC1陽性患者的預后好于陰性患者，且與生存顯著相關，考慮與病例大多為早期患者有關。多因素分析顯示ERCC1不是影響預后的獨立因素，但進一步亞組分析顯示I～II期ERCC1陽性表達者的生存趨勢好于Ⅲ期ERCC1陽性表達者(P＜0.05)。

PD-1多存在于活化的T細胞表面, 與配體PD-L1結合后會抑制相關細胞因子的分泌，從而發揮免疫自身穩定功能, 阻止免疫激活造成的機體損傷，這也成為腫瘤細胞發生免疫逃逸的主要機制之一[14]。目前研究發現，PD-1在肝癌、食管癌、肺癌、乳腺癌、胃癌等多種惡性腫瘤中呈高表達狀態[15-17]。有報道[18]表明PD-1在NSCLC組織中的高表達狀態與患者的臨床病理特征及無進展生存期無關。Yin等[19]研究發現，PD-1的表達與吸煙情況、淋巴結轉移有關，并且其與預后相關，陽性表達者生存期短，預后差。本研究結果顯示PD-1在癌組織和癌旁組織中的表達，與淋巴結轉移及TNM分期有關，PD-1陰性患者的5年生存率及中位生存期好于陽性患者，但PD-1不是影響預后的獨立因素，這一結果與Yin等[19]研究結果相符。

肺癌的發生十分復雜，目前普遍認為它是一個多重因素參與并經歷多個發展階段的疾病，是個體遺傳因素和環境危險因素相互作用的結果。ERCC1作為基因修復過程中的重要因素, 成為研究熱點，而PD-1是免疫治療與腫瘤微環境中重點研究對象。本研究探討了ERCC1和PD-1的相關性，發現二者并無關聯，目前對于ERCC1和PD-1共表達的研究尚少，還需更多的研究驗證二者關系。

綜上所述，ERCC1和PD-1在NSCLC組織中均有不同程度的表達，聯合檢測癌組織中ERCC1和PD-1對NSCLC早期診斷和精準化、個體化治療具有重要意義。