一株拮抗茶炭疽病菌的木霉菌發酵液對茶樹幼苗的促生作用

周羅娜，陳銀翠，周玉鋒*，趙興麗，盧聲潔，劉 輝*，羅林麗，賀圣凌

1.貴州省農業科學院 生物技術研究所/貴州省農業生物重點實驗室，貴州 貴陽 550006；2.貴州師范大學 生命科學學院，貴州 貴陽 550025；3.貴州大學 茶學院，貴州 貴陽 550025

木霉菌（Trichoderma spp.）可產生一系列對植物病原菌有拮抗作用的生物活性物質，提高農作物的抗逆性，有效控制植物病害發生[1-2]并促進植物生長。木霉菌的生物防控及促生作用已成為近年來研究的熱點。李松鵬等[3]研究發現兩株能夠防治水稻紋枯病及促進水稻生長的哈茨木霉菌，陸淼等[4]研究發現了一株對甜瓜幼苗有促生作用及對甜瓜蔓枯病病原菌有抑制效果的木霉菌，馬賽等[5]研究發現了一株對大白菜有促生作用及對根腫病有防治效果的哈茨木霉菌，趙玳琳等[6]研究了棘孢木霉GYSW-6 mL對草莓炭疽病的生防機制及其防病促生作用。在田間應用上，徐培培[7]等研究發現，在常規施肥的基礎上，每667 m2添加哈茨木霉菌劑4 kg可減少水稻田20%的肥料用量，且水稻產量可比常規施肥增加，并減少水稻稻曲病、紋枯病的發生；盧德鵬等[8]通過田間試驗檢測得到木霉菌水分散粒劑（1×108cfu/g）對小麥紋枯病的防治效率可達71.59%，小麥增產率為16.8%；趙遠征[9]等研究發現哈茨木霉可濕性粉劑、木霉菌·促生芽孢桿菌顆粒劑對馬鈴薯黑痣病均有防治效果和增產效果，且木霉菌·促生芽孢桿菌顆粒劑的防治效率最高可達76.33%，增產17.50%。以上研究均表明，木霉菌劑開發與使用能夠有效減少作物化肥、農藥的施用。本實驗室前期分離得到了一株對茶炭疽病菌有較好拮抗作用的木霉菌[10-11]，但此菌株對茶樹是否具有促生作用還未明確。

本研究通過盆栽試驗，測定木霉菌發酵液對茶樹幼苗生長指標（株高、根長、根重）、葉綠素總量、MDA摩爾質量濃度和酶活性（PPO、POD、PAL）的影響，以明確該木霉菌發酵液對茶樹幼苗的促生作用。以期為木霉菌新型生物制劑的開發利用與茶產業的綠色發展奠定基礎，達到茶園“雙減”效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

木霉菌（Trichoderma asperelloides）：由本實驗室分離保存，對茶炭疽病菌有拮抗作用。

1.1.2 種子

福鼎大白茶茶樹種子，采自貴州省農科院茶園。

1.1.3 培養基

PDA培養基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂 20 g、蒸餾水 1000 mL。

PDB培養基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、蒸餾水 1000 mL。

發酵培養基：馬鈴薯200 g、葡萄糖18.34 g、酵母浸膏1.88 g、磷酸氫二鉀0.86 g、硫酸亞鐵0.63 g、蒸餾水 1000 mL。

1.2 方法

1.2.1 木霉菌發酵液的制備

平板活化：在PDA培養基上接種直徑5 mm木霉菌菌餅，28℃ 恒溫培養，培養7 d。

種子液培養：在500 mL錐形瓶中裝 100 mL PDB培養基，從平板上挑取菌落接種于搖瓶中，培養溫度 28℃，搖床轉速120 r/min，培養 3 d后進行接種發酵。

發酵培養：在 500 mL 錐形瓶中裝 100 mL發酵培養基，向培養基中接種1%的種子液，培養溫度 28℃，搖床轉速 120 r/min，培養 7 d。

發酵液制備：發酵完成后，將發酵液經抽濾去除菌絲后即得試驗用發酵液。

1.2.2 木霉菌發酵液對茶樹幼苗的促生試驗

茶樹種子消毒：選取大小均一、顆粒飽滿的福鼎大白茶茶樹種子，放入3%次氯酸鈉中浸泡1 min進行表面消毒，消毒完成后用清水將茶種表面清洗干凈。

茶樹種子催芽：使用40℃～ 60℃溫水將表面消毒完成的茶樹種子浸泡48 h（每8 h換一次水）。浸泡完成后，將茶樹種子放入濕潤的蛭石中，25℃條件下進行催芽。

茶苗灌根處理：待茶苗長出約1 cm時，將長勢相近的茶苗移栽到盛有營養土的育苗盤中，進行灌根處理。將發酵液制備成原液、稀釋50倍、稀釋150倍等3種濃度，用注射器分別吸取制備好的發酵液 20 mL，在移栽后的 0 d、5 d、10 d、15 d注入土中，同時注入等量的水作為對照（CK）。

在灌根處理后的20 d，分別測量株高、根長、根重。并測定葉綠素總量、過氧化物酶、多酚氧化酶、丙二醛濃度、苯丙氨酸降解酶的活性。每組實驗設3個重復。

1.2.3 物質含量和酶活性的測定

物質含量和酶活性測定方法：葉綠素總量采用乙醇提取-比色法[12]、丙二醛MDA采用硫代巴比妥酸法、多酚氧化酶PPO采用鄰苯二酚法、苯丙氨酸解氨酶PAL采用苯丙氨酸比色法、過氧化物酶POD采用愈創木酚法。過氧化物酶、多酚氧化酶、苯丙氨酸解氨酶、丙二醛的測定均使用上海索橋生物科技有限公司的試劑盒。

2 結果與分析

2.1 對茶樹幼苗生長指標的影響

2.1.1 根長與根重

由表1可知，不同濃度的發酵液對茶樹幼苗進行灌根處理20 d后，根長、根重差異較明顯。其中，木霉菌發酵原液對茶樹幼苗的根長、根重具有抑制作用；木霉菌發酵液稀釋50倍液和稀釋150倍后，對茶樹幼苗的根長、根重均有促進作用（圖1）；當木霉菌發酵液稀釋50倍時促生作用最為明顯，相比CK，根長增加40.4%，根重增加 61.70%（P< 0.05）。

表1 不同濃度木霉菌發酵液處理后的 茶樹幼苗根長與根重Table 1 Root length and root weight of tea seedlings treated with different concentrations of Trichoderma spp. fermentation broth

2.1.2 株高

由表2可知，木霉菌發酵原液、稀釋150倍液處理后的茶樹幼苗的株高，相對CK差異不顯著。木霉菌發酵原液對株高稍有抑制作用，稀釋150倍液稍有促進作用，稀釋50倍液的株高明顯高于CK（圖1），增加量達12.57%。

表2 不同濃度木霉菌發酵液處理后的茶樹幼苗株高Table 2 Plant height of tea seedlings treated with different concentrations of Trichoderma spp. fermentation broth

圖1 不同濃度木霉菌發酵液處理后的茶樹幼苗生長情況Figure 1 Growth of tea seedlings treated with different concentrations of Trichoderma spp. fermentation broth

2.2 對茶樹幼苗物質含量和酶活性的影響

2.2.1 葉綠素總量

由表3可知，不同濃度木霉菌發酵液處理茶樹幼苗20 d后，對茶樹葉片的葉綠素總量影響不同。稀釋50倍的木霉菌發酵液條件下茶樹幼苗的葉綠素總量比對照增加14.71%，原液和稀釋150倍液均使茶樹幼苗的葉綠素總量減少。

表3 不同濃度木霉菌發酵液處理后的 茶樹幼苗葉綠素總量Table 3 Total chlorophyll content of tea seedlings treated with different concentrations of Trichoderma spp. fermentation broth

2.2.2 丙二醛（MDA）摩爾質量濃度

由圖2可知，用不同濃度木霉菌發酵液處理茶樹幼苗20 d后，MDA摩爾質量濃度較CK均有所下降，下降幅度為1.77%～27.93%。當木霉菌發酵液稀釋50倍時，MDA摩爾質量濃度下降最為明顯，較對照降低了27.93%（P< 0.05）。

圖2 不同濃度木霉菌發酵液處理后的茶樹幼苗MDA摩爾質量濃度Figure 2 MDA molar mass concentration of tea seedlings treated with different concentrations of Trichoderma spp. fermentation broth

2.2.3 多酚氧化酶（PPO）活性

由圖3可知，木霉菌發酵原液和稀釋150倍液均使茶樹幼苗的PPO酶活性顯著降低， 稀釋50倍液使茶樹幼苗的PPO酶活性顯著增高，較對照 CK 增加 31.47%（P< 0.05）。

圖3 不同濃度木霉菌發酵液處理后的茶樹幼苗PPO活性Figure 3 PPO activity of tea seedlings treated with different concentrations of Trichoderma spp. fermentation broth

2.2.4 苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性

由圖4可知，木霉菌發酵原液和稀釋150倍液均使茶樹幼苗的PAL酶活性降低，但不顯著；稀釋50倍液使茶樹幼苗的PAL酶活性顯著增高，較對照增加 10.64%（P< 0.05）。

圖4 不同濃度木霉菌發酵液處理后的茶樹幼苗PAL活性Figure 4 PAL activity of tea seedlings treated with different concentrations of Trichoderma spp. fermentation broth

2.2.5 過氧化物酶（POD）活性

由圖5可知，木霉菌發酵原液和稀釋150倍液均使茶樹幼苗的POD酶活性降低，稀釋50倍液使茶樹幼苗的POD酶活性增高，比對照CK增加4.21%，增加幅度不顯著。

圖5 不同濃度木霉菌發酵液處理后的茶樹幼苗POD活性Figure 5 POD activity of tea seedlings treated with different concentrations of Trichoderma spp. fermentation broth

3 結論與討論

本試驗以對茶樹炭疽病菌有拮抗作用的一株木霉菌為試驗菌株，通過盆栽試驗測定其發酵液對茶樹幼苗的促生作用。結果表明，使用稀釋50倍的木霉菌發酵液對茶樹幼苗進行灌根處理20 d后，茶樹幼苗的株高、根長和根重增長明顯，增幅分別達12.57%、40.40%和61.70%。

通過測定茶樹幼苗葉片葉綠素總量、MDA摩爾質量濃度以及PPO、POD、PAL酶活性，可以得出，經稀釋50倍的木霉菌發酵液灌根處理20 d后的茶樹幼苗，葉綠素總量明顯增加，增幅為 14.71%（P < 0.05）；MDA 摩爾質量濃度明顯降低，降幅為 27.93%（P < 0.05）；PPO、POD、PAL酶活性增高，增幅分別為31.47%（P < 0.05）、10.64%（P < 0.05）和 4.21%。

葉綠素是影響植物光合作用過程的重要色素，葉綠素含量的多少直接影響植物體光合作用的強弱和植物體有機物的合成與積累[13]。在本試驗中，稀釋50倍的木霉菌發酵液處理過的茶樹幼苗葉綠素總量與對照比較明顯增加，有利于茶樹幼苗物質的量的積累，可為后期提升茶葉產量奠定基礎。

PPO作為植物體內重要的氧化酶，可將多酚物質直接氧化為醌類物質形成保護性屏蔽使植物細胞免受病菌的侵害，發揮抗病作用；同時醌類化合物參與合成木質素，促進細胞壁的木質化，抵抗病原菌的侵染。木質素是植物抵抗病原菌侵入和擴散的重要防衛手段，POD催化脂肪族、芳香族和酚類的氧化，是木質素合成的關鍵酶之一[14]，POD酶活性與植物的抗病性密切相關。PAL作為苯丙烷類代謝途徑的關鍵酶，在植物生長發育、防紫外線輻射、抵御病蟲害方面起著重要的作用。PAL活性與植物抗病性呈正相關，可作為衡量植物抗逆性強弱的指標[15-16]。本試驗中，PPO、POD、PAL酶活性均有所增加，結果說明稀釋50倍的木霉菌發酵液可提高茶樹幼苗的抗病性。其中茶樹PPO酶活性的增加，可增加茶葉的風味，提高茶葉品質[17-18]。

MDA作為細胞脂質過氧化的最主要終產物，可以反應植物細胞中膜脂過氧化程度，MDA濃度與膜脂過氧化程度呈正相關，MDA濃度越高，說明細胞中膜脂過氧化程度越高，細胞膜損害越嚴重。本試驗中，經稀釋50倍的木霉菌發酵液灌根處理20 d后的茶樹幼苗MDA濃度明顯降低。此結果說明稀釋50倍的木霉菌發酵液明顯降低了茶樹幼苗的細胞膜過氧化程度，增加了茶樹幼苗對生長環境的抗逆性，此結果與PPO、POD、PAL酶活性結果相一致。

以上結果是通過室內盆栽試驗證明的，田間應用效果還有待進一步研究。