“金花”散茶中可溶性碳水化合物的浸提及測定方法比較

向 陽，劉 雁，禹利君*，徐詩鈺，賀軍輝，劉仲華，王坤波，劉亞玲

1. 永順縣農業農村局，湖南 永順 416700；2. 湖南農業大學 茶學教育部重點實驗室，湖南 長沙 410128；3. 湖南華萊生物科技有限公司，湖南 益陽 413513

“金花”散茶采用冠突散囊菌（俗稱“金花”）調控發花，產生眾多微生物代謝產物[1]，與黑毛茶、黃茶、白茶等輕發酵茶風味明顯不同；與發花前黑毛茶樣相比，湯色上增加了紅色、橙色，滋味上減少了澀度、增加了甜度。金花越茂盛，茶湯色澤向橙紅轉變越顯著、滋味回甘度越明顯[2-3]。“金花”散茶中的可溶性碳水化合物對代謝綜合癥及腸道菌群有很好的改善作用[4-6]。當前茶葉可溶性碳水化合物的提取測定，習慣沿用“茶樣熱水浴浸提45 min的蒽酮比色法”[7]，對于金花茂盛的新型發花茶類，該方法是否能實現可溶性碳水化合物的準確測定，未見相關文獻報道。本試驗以“茶樣熱水浴浸提45 min”為對照，分別比較了常規沸水浴浸提、超聲波輔助浸提、索氏回流浸提等三種方法對“金花”天尖散茶及二級黑毛茶加工的“金花”散茶的浸提效果，為“金花”散茶中可溶性碳水化合物的提取及準確測定提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

湖南農業大學長安茶學教學實習基地2019年春季學生教學實習制備的黑茶天尖原料及“金花”天尖散茶、湖南華萊生物科技有限公司提供的2019年夏季二級黑毛茶及以此原料制備的“金花”散茶。

1.2 主要儀器及試劑

島津UV-1800紫外可見分光光度計、湘儀TD5S-WS離心機、昆山美美KQ-3200E超聲波清洗器、鈺楊60 mL微型索氏提取裝置、德爾微型粉碎機等。蒽酮、濃硫酸、石油醚、乙醇等試劑均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司；茶湯浸泡用水為怡寶純凈水。

1.3 試驗方法

1.3.1 可溶性碳水化合物反應體系優選

1.3.2 可溶性碳水化合物浸提方法

（A）常規水浴浸提

（B）超聲波輔助浸提

（C）索氏水浴回流浸提

1.4 數據統計分析

測試反應體系3次平行，A、B、C三種浸提方式兩次重復，Excel進行數據預處理，SPSS 22.0進行數據分析，可溶性碳水化合物含量以meanSD表示。

2 結果與分析

2.1 蒽酮反應體系優化

2.1.1 蒽酮反應體系對總可溶性碳水化合物含量測定的影響

葡萄糖對照品濃度梯度為 25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、150 μg/mL、200 μg/mL、250 μg/mL，分別進行0.6%蒽酮硫酸溶液8 mL反應體系a、0.33%蒽酮硫酸溶液4 mL反應體系b。反應體系a葡萄糖對照品吸光度平均值依次為 0.084、0.156、0.317、0.481、0.645和 0.809，一元線性回歸方程為 y = 0.0032x - 0.0029（R2 = 0.9998），對（A）常規水浴浸提的黑毛茶進行測定，其吸光度平均值依次為0.180、0.178、0.185、0.179、0.187、0.190，在標準曲線范圍之內。反應體系b葡萄糖對照品吸光度平均值依次為0.257、0.469、0.906、1.324、1.698和2.171，一元線性回歸方程為 y = 0.0084x + 0.0061（R2 = 0.9995），對（C）索氏水浴回流浸提的“金花”茶樣進行測定，其吸光度平均值依次為1.007、1.010、1.010、0.991、1.012和0.992，在標準曲線范圍之內。由此可知，采用0.33%蒽酮硫酸不僅可獲得良好的葡萄糖對照品及樣品測定，同時還可減少硫酸用量，避免硫酸的潛在危害。

2.1.2 茶湯稀釋倍數的影響

黑毛茶、黃茶、白茶等輕發酵茶其總可溶性碳水化合物蒽酮反應經驗體系為：3.0 g茶水浴浸提 45 min 后定容至 500 mL，取 1 mL 茶湯進行反應測定[7]。發花茶類因“金花”參與了茶葉代謝產物的深度轉化，茶湯滋味甜度明顯增加，色澤較黑毛茶、黃茶、白茶等輕發酵茶茶湯色澤明顯加深，預實驗發現直接取用1 mL茶湯反應其吸光度超出了標準曲線有效范圍。配制濃度梯度 25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、150 μg/mL、200 μg/mL、250 μg/mL 葡萄糖對照品，以反應體系b進行A620 nm吸光度測定，其平均值依次為0.058、0.102、0.201、0.303、0.401 和0.489，一元線性回歸方程為 y = 0.0019x + 0.0082（R2 = 0.9995）。測試樣品茶湯經不同稀釋倍數比較發現，天尖、二級黑毛茶及其“金花”散茶其茶湯稀釋倍數以5 ～ 10倍為宜。由此可知，茶葉后發酵程度不同導致了茶葉中可溶性碳水化合物含量不同，蒽酮測試反應體系其茶湯稀釋倍數也需對應調整，才能得到可靠的測定結果。

2.1.3 活性碳對葡萄糖及茶湯中總可溶性碳水化合物吸附的影響

與超聲波輔助浸提、索氏水浴回流浸提方法比較，常規水浴浸提沒有添加石油醚去脂、乙醇去蛋白，僅100℃沸水浴45 min，選擇加入適量活性碳（料液比1∶100）對茶湯中色素進行吸附，以減少色素物質對總可溶性碳水化合物測定的影響。結果發現：選取150 μg/mL葡萄糖對照品溶液100 mL、加入0.5 g活性炭、120 r/min振蕩回旋30 min后進行蒽酮比色法測定，葡萄糖回收率為94.15% ～ 106.44%，說明活性碳對葡萄糖吸附作用不明顯；對天尖及二級黑毛茶發花的“金花”散茶浸提液參照葡萄糖對照品處理方式進行活性碳吸附，結果發現可溶性碳水化合物含量下降了65.99% ～ 76.95%。由此推知，茶湯中可溶性碳水化合物與色素物質緊密結合，在去除色素的同時也帶走了可溶性糖。可見，活性炭不適合在測試樣品茶湯中添加。

2.2 不同浸提方法對天尖及“金花”天尖散茶可溶性碳水化合物含量的影響

以不同浸提方法進行“金花”天尖散茶及天尖原料浸提，提取液稀釋5倍，進行反應體系b即4 mL 0.33%蒽酮-硫酸體系比色法測定。表1測定結果可知，三種浸提方式顯示經發花后可溶性碳水化合物含量均極顯著增加；對天尖及“金花”天尖散茶而言，超聲波輔助浸提與常規水浴浸提效率相當；索氏水浴回流浸提時間長達2.5 h，其可溶性碳水化合物含量也最高，分別達到6.45%和9.96%，但每批次處理樣品少。綜合分析可知，若樣品少，為實現可溶性碳水化合物含量精準測定，索氏水浴回流浸提為最優方法；若樣品量大，為比較實驗處理導致的可溶性碳水化合物含量差異，常規水浴浸提、超聲輔助浸提為首選，但超聲輔助浸提每批次處理的樣品量更大，能耗更低。

2.3 不同浸提方法對二級黑毛茶及其“金花”散茶可溶性碳水化合物含量影響

以不同浸提方法進行二級黑毛茶及發花散茶茶樣浸提，提取液稀釋10倍，進行反應體系b測定。表2測定結果可知：超聲波輔助浸提、索氏水浴回流浸提更加有助于發花散茶中可溶性碳水化合物浸提，與其二級黑毛茶比較，差異均達到了極顯著水平；常規水浴浸提條件下其發花前后可溶性碳水化合物含量沒有顯著差異。由此可知，對于原料較粗老的茶葉及其加工出的“金花”黑茶產品，需要較長時間的索氏回流或超聲波輔助高效提取，才能獲得較高的可溶性碳水化合物浸提率。

表1 天尖及“金花”天尖散茶可溶性碳水化合物含量比較 （%）Table 1 Comparison of soluble carbohydrate extraction contents of Tianjian and “Jinhua” Tianjian loose tea （%）

表2 二級黑毛茶及其“金花”散茶中可溶性碳水化合物含量比較 （%）Table 2 Comparison of soluble carbohydrate extraction contents of 2th grade raw dark tea and its “Jinhua” loose tea（%）

3 討論

蒽酮-硫酸比色法是一種測定樣品中單糖、雙糖和多糖含量的常用方法，樣品中的糖類在濃硫酸作用下，脫水生成糠醛及其衍生物與蒽酮發生反應呈藍綠色，顏色深淺不一，糖的含量也不相同；常規反應體系以葡萄糖為對照品，1 mL 茶湯與 8 mL 0.6% 蒽酮 -硫酸溶液沸水浴8 min進行比色測定，可實現茶葉中可溶性碳水化合物含量快速測定。為探究蒽酮反應體系的濃度及適當用量，王黎明等對純化的茶多糖進行研究發現，4 mL 0.05%的蒽酮-硫酸與1 mL純化的多糖溶液反應，可獲得理想測定結果[8]；傅博強等對茶葉中多糖含量測定采用吸取1 mL茶湯與4 mL 0.33%蒽酮-硫酸溶液沸水浴7 min進行反應，取得了理想測試結果[8]。由此可知，減少蒽酮硫酸用量及濃度，對茶葉中可溶性糖測定是可行的。然而，可溶性糖在茶葉的配比組成存在差異，茶葉樣品是以葡萄糖為基本組成，但茶花等樣品是以半乳糖為基本組成。為此，以葡萄糖還是半乳糖作為檢測對照品，張海星等研究發現需根據原料情況選擇相應分析測試體系[10]；本試驗通過將常規反應體系a與減少蒽酮-硫酸濃度及用量的反應體系b進行對比研究發現，采用反應體系b對“金花”散茶及其發花原料可獲得良好測定結果，同時也減少了濃硫酸的用量。

黑茶原料經冠突散囊菌發花產生了復雜的生物化學反應及代謝產物，發花后的黑茶新增了油脂類、色素、可溶性碳水化合物等多種風味物質[1]。已有研究報道，為減少油脂對玫瑰葉中可溶性多糖含量測定結果的干擾，采用石油醚回流脫脂[11]；王雪媛等研究發現，肉蓯蓉油脂、蛋白含量極高，加入95%乙醇水浴回流2 h可減少對多糖含量測定結果的干擾[12]；茶葉經冠突散囊菌發花后產生了較多的色素及油脂類物質[1]，在劉雁等感官審評結果也得到了明顯體現[2]。從本試驗測定結果（表1、表2）分析可知，熱水浴浸提后茶湯中色素、油脂、蛋白沒有對測定結果產生干擾；活性碳對葡萄糖對照品吸附可以忽略不計，但加到茶湯中脫色會造成茶湯中糖類物質大量被吸附，因此活性碳不宜添加到茶湯中。超聲波輔助浸提、索氏水浴回流浸提均采用石油醚脫脂、乙醇去蛋白，80%乙醇浸提離心棄上清。從測定結果（表1、表2）來看，與常規水浴浸提比較，超聲波輔助浸提量略有升高、索氏水浴回流浸提量明顯升高。因此，若僅是對大批量樣品進行可溶性碳水化合物含量測定，為減少工作時間、節約能耗，超聲波輔助浸提為首選；若需準確測定“金花”黑茶中可溶性碳水化合物含量，索氏水浴回流浸提盡管歷時長、操作繁瑣，不便于實現大批量樣品浸提，但可獲得可溶性碳水化合物含量的充分浸提以達到準確測定。