一種乳鼠海馬神經元原代培養方法的優化與鑒定*

吳倩 ，穆婷婷 ，汪寧

1 安徽中醫藥大學 安徽合肥 230012

2 中藥復方安徽省重點實驗室，安徽中醫藥大學 安徽合肥 230012

3 安徽省中醫藥科學院中藥藥效與安全評價研究所，安徽中醫藥大學 安徽合肥 230012

海馬是大腦邊緣系統的重要組成部分，參與學習、記憶、情緒反應等多種高級精神活動[1]。同時，海馬也是腦組織中對低氧最敏感的區域，因此，原代培養海馬神經元細胞適用于缺血性腦損傷模型的制備及研究[2]，但海馬神經元的培養過程較為復雜，細胞及其嬌嫩，培養過程可變因素較多，因此，進一步優化其培養過程，對于獲得純度較高生長穩定的海馬神經元極為重要。本文通過對國內外相關文獻的參考，并在實際操作中不斷摸索和改良，對海馬神經元的培養進行了優化，以期為腦缺血的體外研究提供更好的模型。

材料和方法

1 材料

1.1 實驗動物 健康新生24h的SD大鼠，雌雄不限，由安徽醫科大學實驗動物中心提供。

1.2 實驗試劑 L-多聚賴氨酸（7~15萬單位），Sigma公司；胰蛋白酶消化液，碧云天生物技術研究所；胎牛血清（FBS）、Neurobasal Medium培養基、B27（神經營養因子），L-Glutaminne（谷氨酰胺），Gibco公司；PBS緩沖鹽；Map-2、Cy3熒光二抗等。

1.3 實驗器具與儀器 手術器具：眼科剪（3把）、彎鑷（3把）、直鑷（1把）、紗布若干、培養皿（2個）、漏斗（2個）、玻璃吸管（2根）、青霉素瓶若干、15mL離心管若干，以上物品需提前高壓后使用；冰盒（-20℃）。

儀器：恒溫 CO2細胞培養箱，超凈工作臺，倒置顯微鏡，熒光倒置顯微鏡。

2 實驗方法

2.1 培養皿的處理 實驗選用6孔培養板進行細胞培養，用終濃度為0.1%的多聚賴氨酸，于培養箱進行包被鋪板，約30min~1h，包被結束后回收多聚賴氨酸，用無菌PBS沖洗6孔板2遍，待用。

2.2 海馬神經元的培養

2.2.1 分離海馬組織 將出生24h的SD大鼠經75%酒精消毒，剪開顱骨，取出全腦組織，浸于盛有預冷PBS溶液的培養皿中，使用彎鑷去除小腦和腦干部分，然后分離左右兩半球，海馬位于半球的腹內側，完整取出“新月形”海馬組織，輕輕去除粘連的腦組織和血管，并將剝離的海馬組織移入另一個干凈已預冷的PBS溶液培養皿中輕輕漂洗，再移至裝有2mL PBS的無菌青霉素瓶子中，用眼科剪快速剪碎呈1mm×1mm×1mm大小。

2.2.2 消化及離心 加入2mL濃度為0.25%胰蛋白酶，使其終濃度為0.125%，置于37℃溫箱中，消化約10～15min，每隔10min緩慢搖勻一次以充分消化。待組織呈粥糜狀時，加含10%血清的F12培養基4 mL終止消化，用玻璃吹管輕輕吹打組織團塊，使其變成懸濁液，1000r/min，離心5min，棄上清。

2.2.3 細胞接種 加入接種培養基（含10%血清的DMEM/F12）重懸沉淀，用細胞計數儀記錄當前的細胞數目，并根據實驗目的調整細胞的密度。置于37℃、5%CO2孵箱中培養。

2.2.4 細胞換液 第2d半量換為完全培養基：Neurobasal+B27培養基（含濃度為0.2mol/L-1的谷氨酰胺），后每2天換液（完全培養基）1次，生長8d后，用于實驗，見圖1。

2.3 海馬神經元的觀察 倒置顯微鏡觀察海馬神經元在不同時間段的形態學變化并拍照，比較觀察細胞的生長狀態和突起的形成。

圖1 海馬神經元原代培養步驟

2.4 海馬神經元的免疫熒光鑒定 從培養箱將培養至第8 d的海馬神經元取出，吸去培養液，用PBS輕輕漂洗細胞2遍，加入4 %多聚甲醛固定30min。固定結束后，用PBS輕輕漂洗3遍，置于搖床上慢速搖晃，每次漂洗10min，以棄去多余的多聚甲醛。封閉30 min，棄上清液，加入一抗（小鼠抗Map-2，小鼠抗Cy3），4 ℃過夜進行孵育。第二天取出培養板（或皿），棄上清液，用PBS輕輕漂洗3次，漂洗時置于搖床上慢速搖晃，每次10min，結束后加入二抗，37 ℃孵育1 h，避光操作。避光條件下快速用PBS漂洗3次，置于熒光顯微鏡下，觀察，拍照，Map-2和Cy3免疫熒光，陽性細胞的胞體和樹突分別會呈現綠色熒光和橙紅色熒光。

結 果

1 海馬神經元形態學觀察

圖1顯示，培養24h后，大部分海馬神經元一已貼壁，胞體透亮、飽滿，較強立體感，細胞周圍有光暈，折光性強。其少數細胞已長出突起，長短不一，但未見相鄰突起之間的連接。培養3～5d時，神經元呈現典型形狀，胞體明顯增大，多為圓形，表面光滑，折光性強，突起明顯增長，可見較多突起相互連接成稀疏網絡。培養7～9d時，神經元胞體開始聚集，突起增粗增長，突起形成的網絡更密集。

2 海馬神經元的鑒定

取第8天的海馬神經元進行cy3和Map-2免疫熒光鑒定，所培養神經元形態典型片，細胞核染色清晰，細胞與細胞間成網狀連接，細胞發出明顯的紅色熒光和綠色熒光，，純度達98%以上。

討 論

海馬是中樞神經系統中的特殊結構，涉及學習、記憶、情緒反應等多種復雜的生理功能，在臨床研究中十分廣泛，且對缺氧極為敏感，因此建立海馬神經元原代培養的優化方法，是促進神經元相關疾病研究的必要條件[3，4]。為獲得純度更高、更接近人體狀態的神經元細胞，在檢索大量國內外文獻的基礎上，本研究對以往的培養方法做了以下改進。

1 動物選擇

理論上海馬神經元的培養應選擇胎鼠，但胎鼠的鼠齡難以掌握加之海馬非常小加大取材難度，所以本實驗選用出生24h的乳鼠作為實驗對象，降低操作過程的復雜度，且不傷害孕鼠，節約資源。

2 控制溫度和時間

將乳鼠全腦組織置于預冷的PBS溶液中，再分離海馬，低溫環境可以降低細胞代謝率，維持細胞充分的活力。每只乳鼠的取材時間控制在3～5min，總的時間控制在60min內，以時間過長造成神經元失去活力甚至死亡。

3 消化過程不可過長

整個消化過程在培養箱中進行，每隔5min搖勻1次以充分消化。

圖2 海馬神經元的生長狀態（×200）

圖3 免疫熒光檢測海馬神經元（×400，第8天）

4 吹打力度和次數

終止消化后，通過吹打獲得單細胞原液，力度要溫和，本實驗使用1mL槍頭代替膠頭滴管進行吹打，最終獲得單細胞懸液。

5 培養基的區分

本實驗選用含10%血清的F12/DMEM培養基作為終止消化的接種培養基；第二天半量換液及置換換液選用Neurobasal+B27培養基（含0.2mol/L-1的谷氨酰胺）。Neurobasal培養基成分清楚，含有多種抗氧化劑，能夠保持神經元的活性，有利于實驗條件的穩定[5]；B27具有保護神經元的作用；谷氨酰胺為神經元代謝所必需物質[6]，但容易降解，故2周應重新添加至完全培養基中。

6 不添加雙抗和阿糖胞苷

雙抗對細胞損傷較大，阿糖胞苷具有神經毒性，添加阿糖胞苷可以抑制膠質細胞生長的同時也會損傷神經元[7，8]，通過精細取材海馬組織，在未加雙抗和阿糖胞苷的情況下，仍可獲得純度較高的海馬神經元。

綜上所述，本方法培養的海馬神經元較對照組更容易貼壁，細胞生長狀態較好，細胞之間能夠建立神經纖維網絡，形成有效的突觸聯系; 為神經細胞的相關研究確定了原代神經元細胞的培養方法。