染色體異常及AZF缺失與男性睪丸活檢無精癥的關系

于瑞梅，房 格，王丹丹，辛 瑞，趙 雪，劉 雯

（山東大學附屬生殖醫院 國家輔助生殖優生工程技術研究中心 生殖內分泌教育部重點實驗室 山東省生殖醫學重

點實驗室 山東 濟南 250001）

據世界衛生組織（World Health Organization, WHO）統計，育齡夫婦中約1/10患有不孕不育癥，其中男性不育約占50%[1]。無精子癥是男性不育的常見原因，約占男性不育癥l0%～20%。無精子癥包括梗阻性無精子癥（obstructive azoospermia, OA）與非梗阻性無精子癥（non-obstructive azoospermia, NOA）[2]。OA明確梗阻部位及原因后，可通過外科手術治療獲得子代；NOA發病率占無精子癥的40%～60%，原因包括隱睪、免疫學不育、睪丸腫瘤、染色體異常、特發性男性不育等[3]。睪丸活檢是診斷NOA的金標準，睪丸活檢根據生精細胞阻滯的不同階段及有無精子可分為三種，包括生精功能低下（hypospermatogenesis, HS），生精功能阻滯（germ cell mature arrest, MA）和唯支持細胞綜合征（sertoli cell only syndrome, SCOS）[4]。

研究證實NOA與染色體異常及Y染色體微缺失（azoospermic factor, AZF）關系密切[5]。在精子生成過程中染色體重排會導致染色體異常，染色體異常包括性染色體異常、常染色體異常以及染色體多態等。染色體異常的比例在男性不育中的比例為2.1%～28.4%，在正常人群中的比例為0.7%～1%[6]。AZF定位于Y染色體長臂上（Yq11），存在多種與精子生成相關關鍵基因位點。該區域包含4個非重疊區域（AZFa、AZFb、AZFc、AZFd）。除克氏綜合征外，AZF缺失常認為是引起男性不育最常見細胞遺傳學因素[7]。因此，對男性不育患者進行染色體核型分析與AZF缺失檢測可明確部分不育患者的病因，并為進一步臨床治療提供科學依據。目前對遺傳學異常在男性不育人群中的研究較多，本研究首次對染色體異常核型及AZF缺失在經睪丸活檢的NOA中發生率進行了分析。

1.資料與方法

1.1 一般資料

對象來源于2018年10月—2019年12月就診于山東大學附屬生殖醫院的門診患者，病例組203例NOA，根據WHO《人類精液檢查與處理實驗室手冊（第5版）》[8]進行兩次以上精液檢查均未發現精子患者，經睪丸活檢進行病理分型，將已知不育因素排除，如先天性異常、隱睪、輻射、藥物、睪丸腫瘤等。病例組共203例，HS組63例，MA 31例，SCOS 109例，對照組選擇400例精液參數正常健康男性，對照組接受與NOA相同檢查（睪丸活檢除外）。所有患者知情同意并經山東大學倫理委員會討論通過（倫理審批號：2014042）。

1.2 睪丸活檢

病例組均通過睪丸體外取精（testicular sperm extraction, TESE），將Bouin, s液保存睪丸活檢標本進行病理分析。HS：查見精子；MA：無精子生成，阻滯在生精細胞某個階段；SCOS：曲細精管內僅查見支持細胞。

1.3 染色體核型分析

無菌條件下將肝素鈉抗凝1 mL外周血接種于5 mL 1640培養液中置37℃培養箱培養68～72 h，加秋水仙素2滴，37℃作用1 h 40 min，收獲、制片，G顯帶染色制備標本。采用leica GSL-120全自動掃描分析儀上機掃片，常規計數20個分裂象，分析5個分裂象，發現異常核型時加數到100個分裂象。按人類細胞遺傳學國際命名體制（International system for cytogenetics nomenclature 2016, ISCN 2016）進行外周血染色體核型命名。

1.4 Y染色體微缺失分析

抽取患者外周血，提取DNA進行11個序列標簽位點（sequence-tagged sites, STS）PCR擴增，向1%瓊脂糖中加入1X TAE緩沖液及gene colourⅡ顯色劑，室溫進行100Ⅴ，40 min凝膠電泳，ZFY和SRY作為STS內參照區域，包括：Ⅰ組（ZFX，sY86，sY127，sY153）；Ⅱ組（ZFX/SRY，sY254，sY134，sY255）；Ⅲ組（RBM1，SRY，sY84，sY152）。采用正常男性和女性做陰/陽性對照，對缺失位點分析。

1.5 統計學分析

2.結果

2.1 染色體異常核型分析

病例組36例（17.7%）染色體異常，對照組3例（0.75%）染色體異常，兩組間差異有統計學意義（χ2=64.211，P＜0.01）。在病例組不同病理類型中，染色體核型異常在MA（7/31，22.6%）比例最高。病例組SCOS中，發現18例染色體異常（18/109，16.5%），MA中發現7例染色體異常（7/31，22.6%），HS中發現11例缺失（11/63,17.5%），各病理類型間差異無統計學意義（F=0.614，P＞0.05）。

2.2 AZF缺失分析

病例組有20例（9.9%）AZF缺失，最常見是AZF（c+d）缺失。在病例組SCOS中，9例AZF缺失（9/109，8.3%），MA中9例AZF缺失（9/31，29.0%），HS中2例AZF缺失（2/63,3.2%）。

2.3 染色體異常與AZF聯合缺失分析

病例組2例染色體異常聯合AZF缺失，病理類型均為MA，見表1。

表1 病例組染色體異常聯合AZF缺失分析

3.討論

研究證實，染色體異常與男性不育關系密切。既往針對男性不育NOA的遺傳學研究相對較少[9]，尤其是在NOA不同病理類型中的研究甚少，本文分析了經睪丸活檢不同病理類型NOA患者的染色體及AZF缺失發生比例。

結果發現病例組常染色體的異常比例為1.0%，低于男性不育常染色異常比例（1.1%～7.2%），主要為9號染色體倒位，目前9號染色體異常也成為男性不育研究熱點，有研究證實9號染色異常與男性不育密切相關，本次9號染色體改變2例，結果提示可能與男性不育相關。病例組性染色體異常比例為8.4%（17/203），與性染色體異常平均比例范圍（0.4%～12.3%）一致[10]，其中47，XXY發生比例最高，主要發生在SCOS組，另1例嵌合體發生在MA組，研究認為性染色體嵌合體發生可促進睪丸曲細小管退行性改變，從而抑制精子發生及成熟精子的形成，并可能影響輔助生殖技術成功[11]。染色體多態與男性不育的關系目前尚存爭議，本次染色體多態的比例為8.4%（17/203），其中常染色體的1、13、14、21號染色體和Y染色體的多態較常見，其中Yqh±比例較高，說明上述染色體多態的發生可能與男性不育是相關的[9]，但是本研究中發現了染色體多態是分布在各種不同病理類型中的，體外取精后，雖然子代有同樣染色體多態的可能性，但是其并不是接受產前遺傳學診斷的指征。睪丸活檢的NOA染色體異常比例較高，尤其在生精功能較差的SCOS和MA，結果提示可能與男性不育是相關的。

目前，Y染色體對精子生成調節的病因學關系已成為男性不育研究熱點，本文病例組有20例（9.9%）發生了AZF缺失，缺失比例與歐洲等國家的比例范圍（3.2%～10.5%）相符合，但是低于國內其他地區的研究結果。AZF缺失類型及分布與環境、STS標記、種族因素均有關系，綜合分析，AZF在男性不育人群中缺失比例范圍為3%～55%[12]。在病例組不同病理類型中，SCOS 9例AZF缺失，MA 9例AZF缺失，HS中2例AZF缺失，SCOS和MA的AZF缺失率明顯高于HS，說明SCOS發生AZF缺失可能性更大。AZF（c+d）聯合缺失最常見，主要發生在SCOS和MA中，病例組2例發生了染色體異常聯合AZF缺失，均為MA，結果提示染色體核型異常及AZF缺失在男性不育癥患者中的發生率均較高，聯合缺失更常發生在生精功能較差組內。

綜上所述，染色體異常和AZF缺失在男性不育中比例較高，尤其是在生精功能較差的SCOS和MA中。睪丸體外取精與輔助生殖技術為不育患者帶來生育機會，同時也給其后代帶來不育風險，染色體核型分析和AZF缺失的檢測對男性不育患者病因的明確尤為重要，進行聯合檢測將有助于男性不育癥患者病因的發現，也有助于進一步治療，同時也為男性不育患者的診治以及遺傳咨詢提供科學依據，其意義重大。