血塞通聯合丙泊酚治療創傷性腦損傷療效及作用機制研究

王瓊仙，吳春妍，王利梅，李進濤，張蘭春，鄭紅，曹雪，楊騏睿，李成，吳林雄△

（1 昆明醫科大學實驗動物學部，云南 昆明；2 昆明醫科大學公衛學院，云南 昆明；3 昆明醫科大學藥學院；云南 昆明)

0 引言

血塞通的主要有效成分是三七總皂苷[1]。功能主治是活血祛瘀，通脈活絡，抑制血小板聚集和增加腦血流量，具有止血、鎮痛、散瘀、活血消腫等作用。丙泊酚化學名為2,6-雙異丙基苯酚，是目前臨床上普遍用于麻醉誘導、麻醉維持、ICU 危重病人鎮靜的一種新型快速、短效靜脈麻醉藥[2]。本項目是在復習大量文獻基礎上擬調查血塞通聯合丙泊酚對腦的治療效果，是否是通過上調BDNF 及其受體TrkB 和下游信號分子來實現的。

1 材料與方法

1.1 動物的分組

140只成年SD 大鼠，雌雄各半，體重（200±20）g，隨機分為四組。正常組（假手術組 A 組），TBI+脂肪乳組（腦損傷組 B 組），TBI+丙泊酚組（丙泊酚治療腦損傷組 C 組），TBI+丙泊酚+血塞通組（血塞通聯合丙泊酚治療腦損傷組 D 組）。實驗動物購于昆明醫科大學實驗動物學部，實驗動物質量合格證號：SYSK(滇)2005-0004，許可證號SCXK(滇)2011-0004。

1.2 動物模型建立與藥物治療

采用改良的Feeney 氏法自由落體撞擊制作腦外傷模型[3]。用3.6%水合氯醛(1ml/100g)進行腹腔注射麻醉。麻醉完全后,將大鼠俯臥位固定，常規消毒鋪巾,在頭距前囟5mm 處冠狀切開皮膚成“V”或“U”型切口, 將頭皮向尾側翻開。分離骨膜,暴露右側頂骨,于矢狀縫旁開2.5mm,冠狀縫后1.5mm 鉆一骨孔,咬除顱骨直至骨窗擴大為直徑5.0mm×5.0mm,顯露硬腦膜，注意保護矢狀竇和硬腦膜。將潔凈的墊片輕輕地置于骨窗中央，以50g 重的鐵質圓柱體自30cm 高處沿鐵桿自由落體撞擊墊片,造成右側大腦運動皮質區挫裂傷。假手術僅咬除顱骨，不進行砸傷，飼養護理同手術組。術后前3型每日給腦外傷大鼠腹腔注射頭孢8萬單位預防感染，術后2 周內每日早晨8點給予藥物治療，劑量及給藥方式如下：丙泊酚20mg/kg，腹腔注射。血塞通50mg/kg。

1.3 行為學評價

1.3.1 大鼠的神經功能缺損評分（neurological severity score，NSS）

分別于損傷后1d、3d 和7d 進行神經功能雙盲法評分，三個經過培訓熟練掌握評分標準的人進行評分，取平均值進行統計學評分，每天評分時間固定在早上8：00。

1.3.2 電生理CSEP 皮層體感誘發電位檢測

將大鼠頭部固定于腦立體定位儀平臺,剪去顱頂毛,在前囪部位沿中線切開皮膚1.5cm,鈍性分離,充分暴露顱骨,清楚地暴露顱骨骨縫,在冠狀縫后緣1-2mm、矢狀縫旁開2-3mm,手持電鉆,用2.5mm 球形牙科鉆緩緩鉆磨顱骨,要求恰好鉆到出現白色的、略帶透明的骨皮質,然后用眼科鑷,輕輕挑起殘余的骨皮質,并小心剝離,即可暴露出完好的硬腦膜[4]。然后將銀球引導電極用萬向夾固定于鉆孔處,相當于皮層感覺運動區(額頂區)，隨后將2個注射針頭分別插入大鼠對側前爪腕部的兩側皮膚,刺激輸出的2個電極(注意2個電極不能相觸)，分別連接2個注射針頭,開始刺激并觀察誘發電位的變化。

1.4 樣本獲取

NSS 評分及電生理檢測結束后，開始灌注固定取材，用于形態學研究；每組15只。材料放入4%多甲固定過夜，其它動物模型，分別治療后3d、7d，進行新鮮樣本取材；首先每個時間點10只/組，獲得腦組織，入-80℃冰箱備用。

1.5 統計學分析

2 結果

2.1 NSS 評分

NSS 評分結果見圖1。

圖1 各組間所得神經損傷程度評分

血塞通聯合丙泊酚治療腦外傷中TrKB mRNA 的表達變化：

與3d 時相比，TrKB mRNA 的表達水平在血塞通和丙泊酚聯合治療7d 后明顯降低（P≈0.00＜0.01）。術后1d，脂肪乳組的TrKB mRNA 的表達明顯降低（P≈0.00＜0.01），給予丙泊酚處理后，又顯著逆轉了這一降低（P≈0.00＜0.01）；同樣的損傷后3dTrKB mRNA 的表達水平也被明顯降低（P≈0.00＜0.01），給予丙泊酚處理后其表達較TBI+fat 組明顯進一步降低（P=0.0008＜0.01），然而在血塞通聯合丙泊酚治療組中TrKB mRNA 的表達水平明顯又高于TBI+pro 組（P≈0.00＜0.01）；在術后7d 時，損傷組的TrKB mRNA 的表達量明顯高于Sham 組，各組間的變化趨勢大體與術后3d 相同，損傷后TrKB mRNA 的表達較Sham 組明顯升高（P=0.00000006＜0.01），而丙泊酚治療后則顯著低于TBI+fat 組的（P≈0.00＜0.01），同時在接受血塞通聯合丙泊酚治療后，TrKB mRNA 的表達更進一步降低（P≈0.00＜0.01）。

2.2 電生理CSEP 皮層體感誘發電位結果

血塞通+丙泊酚+TBI 治療后與治療前比較，潛伏期縮短，波幅降低，說明SD 大鼠腦損傷后腦部通路受到一定的損傷[5]。P=0.000 ＜0.01，有顯著統計學差異。

3 討論

本實驗通過建立TBI 大鼠模型，用血塞通聯合丙泊酚治療后與治療前比較，通過行為學評價結果顯示：血塞通+丙泊酚+TBI 治療后與治療前比較，從NSS 評分結果我們發現單純丙泊酚組，血塞通聯合丙泊酚組對TBI 損傷都有治療作用，但通過比較發現聯合用藥組展現出更好的治療效果；而從CSEP 電生理檢測結果我們可以看出TBI 損傷后的確對大鼠的神經傳導功能造成了抑制性的作用[6,7]，經過治療后發現聯合用藥組能夠讓神經傳導功能有一個更好的恢復作用。同時經過使用聯合用藥后丙泊酚TBI組應有的炎癥細胞因子合成釋放被抑制的現象消失了，出現了降低后的一個BDNF 升高表達的上調，從而影響其受體TrkB 升高而上調[8,9]。

綜上所述，本課題血塞通治療TBI 的過程中，對丙泊酚的抗損傷作用，是通過上調BDNF 及其受體TrkB 來實現的，加入血塞通治療TrKB 明顯升高，證明血塞通治療TBI 不僅上調了BDNF，同時也上調了它的受體TrKB,只有兩者同時上調，才能完美結合，發揮BDNF 的生物學神經營養的作用[10-12]。