不同種植體表面性質對雪旺細胞生物學行為影響的研究

王艷穎 宮蘋 張健

1.天津市口腔醫院（南開大學口腔醫院）種植科，天津300041；2.天津市口腔功能重建重點實驗室，天津300041；3.口腔疾病研究國家重點實驗室國家口腔疾病臨床醫學研究中心四川大學華西口腔醫院種植科，成都610041

骨結合的種植體傳遞感覺的能力稱為骨感知[1]。牙種植體存在感覺功能，對此已達成共識[2]。然而，研究[3]證實種植體的觸覺功能與天然牙有所不同。臨床研究表明，與天然牙列的觸覺功能相比，種植體的主動觸覺靈敏度閾值是天然牙的2~3倍[4]，而種植體的被動觸覺靈敏度閾值是天然牙的50倍[5]。因此，提高種植體的感覺功能將有助于種植體在口腔內最終實現生理性整合[6]。

天然牙的感覺主要來自于牙周膜的本體感受器，而種植體周圍并沒有類似天然牙牙周膜的這一特殊結構。近年來的研究[7]證實，在種植術后新形成的骨組織內可以檢測到神經纖維，這些有髓和無髓神經纖維分布在靠近種植體螺紋處的哈弗系統中。組織學研究[8]表明，種植體植入后種植體周圍的神經纖維是以出芽生長的方式進行再生。周圍神經損傷后的修復依賴于軸突的成功再生及雪旺細胞（Schwann cells，SCs）增殖所形成的微環境[9]。因此，在種植體周圍神經再生的過程中，神經元和SCs的生物學行為起著決定性的作用。

種植體的表面性質是影響種植體周圍組織再生的重要因素。不同種植體表面的微結構和化學成分如何影響神經元和SCs的生物學行為，如何影響外周神經傳導，如何促進種植體周圍的神經再生，尤其是感覺神經再生等，都成為種植體周圍神經支配、感覺功能研究中亟待解決的問題。目前，不同表面處理的種植體，特別是化學改性表面對于SCs和神經元的作用尚未明確。本課題擬探討不同種植體表面的微結構和化學成分對SCs生物學行為的影響及其機制，為進一步提高種植體的感覺功能提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 不同種植體表面形態的體外檢測

本實驗選用3種臨床常用的種植體表面，分別是光滑處理鈦表面（smooth polished，SMO）、大顆粒噴砂酸蝕鈦表面（sand-blasted，large grit，acidetched，SLA）、親水性化學活化大顆粒噴砂酸蝕鈦表面（chemically-modified SLA，modSLA）。鈦片直徑為15 mm，厚度為1 mm（Institute Straumann AG公司，瑞士）。利用掃描電子顯微鏡（scanning elec‐tron microscope，SEM）觀察3種鈦片的表面形態。

1.2 SCs的分離、培養、純化、鑒定

取材于出生1 d 的Sprague-Dawley 乳鼠，用顯微器械切取雙側坐骨神經并用磷酸緩沖鹽溶液清洗，在體視顯微鏡下剝離神經外膜，剪成1 mm 的組織塊，依次用0.1%Ⅰ型膠原酶和0.25%胰蛋白酶消化。收集細胞懸液進行離心，去上清液，加入含10%胎牛血清的DMEM 培養基，吹打混勻細胞后，接種于培養瓶中培養。接種24 h 后換成含100 mg·L-1G418 的 DMEM 復合培養基培養 3~4 d以除去成纖維細胞。采用S-100蛋白免疫組織化學法進行鑒定。后續實驗均采用P2代SCs。

1.3 SCs在不同鈦片接種及實驗分組

根據檢測方法，將SCs按所需的密度分別接種于3種鈦片表面。根據鈦片的種類不同，每種檢測均分為3組：SMO組、SLA組、modSLA組。

1.4 SCs的黏附和形態學觀察

SCs 按每孔2×104個接種于鈦片表面，鈦片置于24 孔板中，每組3 片。培養4 h 和24 h 后，從各組分別取出鈦片，經2.5%戊二醛固定，梯度乙醇脫水，臨界點干燥，噴金后在SEM 下觀察鈦片表面的細胞形態。

1.5 SCs的增殖活性檢測

SCs按每孔1×104個接種于鈦片表面，鈦片置于24孔板中，每組3片，分別在接種后的第1、3、5、7 天進行 MTT 檢測。每孔加入 MTT （5 mg·mL-1），37 ℃避光孵育3.5 h 后終止。每孔加入二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），37 ℃避光孵育0.5 h。收集每孔樣本至96 孔板內，在492 nm 波長下測定各孔吸光度值。

1.6 SCs相關蛋白的表達

SCs 按每孔1×104個接種于鈦片表面，鈦片置于24 孔板中，每組3 片。在接種后的第3 天和第7天收集培養液，用酶聯免疫吸附測定（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒檢測神經生長因子（nerve growth factor，NGF）和腦源性神經營養因子（brain-derived neurotrophic fac‐tor，BDNF） 含量。

1.7 SCs相關基因的表達

SCs 按每孔2×105個接種于鈦片表面，鈦片置于6 孔板中，每孔3 片相同鈦片。在接種后的第3天和第7 天提取細胞的總RNA，通過實時熒光定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）檢測NGF和BDNF mRNA表達水平的變化。

1.8 統計分析

實驗獨立重復3 次.所有實驗數據采用SPSS 22.0 軟件進行統計分析。實驗數據以均數±標準差表示，采用單因素方差分析和Tukey法進行統計分析，取P=0.05為顯著性檢驗水準。

2 結果

2.1 不同處理鈦片的表面形態

3 種鈦片的大體觀見圖1，SEM 下觀見圖2。從圖中可見，SMO 鈦片表面有大量形狀不規則、深度較淺的凹陷；SLA 鈦片表面為多級孔狀結構，孔洞形狀不規則，深淺不一；modSLA鈦片干燥后掃描電子顯微鏡圖與SLA鈦片一致。

圖 1 鈦片大體觀Fig 1 Gross view of titanium discs

圖 2 鈦片 SEM ×2 400Fig 2 Titanium discs SEM ×2 400

2.2 SCs的形態學觀察

純化后的P2代SCs呈梭形，兩端有細長突起，少數呈三角形，有3個突起，細胞之間以針狀突起相互連接（圖3 左）。免疫熒光染色可見SCs 標志蛋白S-100表達呈陽性（圖3右）。

SEM 顯示：接種4 h 后，SCs 在各組中黏附均較好，細胞伸出偽足，呈球形黏附在鈦片表面；接種24 h后，SCs伸展成典型的梭形或三角形，以細長突起連接在鈦片表面。SCs 在3 種鈦片表面均良好黏附和伸展（圖4）。

2.3 SCs的增殖活性

各組不同培養時間下SCs 的增殖情況見圖5。從圖5 可見，隨著接種時間的延長，各組OD 值均增大，說明SCs 在各組都可以良好的生長和增殖。第1 天時，各組之間的差異無統計學意義（P>0.05）。第 3、5、7 天時，SMO 組的 OD 值均高于SLA 組和modSLA 組，差異有統計學意義（P<0.05）。第 3 天時，modSLA 組的 OD 值高于 SLA組，差異有統計學意義（P<0.05）；第5 天和第7天時，2 組之間的差異無統計學意義（P>0.05）。這表明，與SLA、modSLA 表面相比，SMO 表面對SCs增殖有明顯的促進作用。

2.4 SCs相關蛋白的表達

各組不同培養時間下NGF 和BDNF 的表達見圖6。1）NGF的表達：第3天時，SLA組和modS‐LA 組高于 SMO 組 （P<0.05），modSLA 組高于SLA 組（P<0.05）；第7 天時，各組之間差異無統計學意義 （P>0.05）。2） BDNF 的表達：第 3 天時，SLA 組和 modSLA 組高于 SMO 組 （P<0.05），modSLA 組 高 于 SLA 組 （P<0.05）； 第 7 天 時 ，SLA 組和 modSLA 組低于 SMO 組 （P<0.05），SLA組和modSLA組之間差異無統計學意義（P>0.05）。

圖 3 SCs 光鏡 ×100Fig 3 SCs light microscope ×100

圖 4 各組不同時間下的形態學觀察 SEM ×2 400Fig 4 Morphological observation of each group under different time SEM ×2 400

2.5 SCs相關基因的表達

各組不同培養時間下NGF 和BDNF mRNA 的表達見圖7。1）NGF mRNA 的表達基本與蛋白表達一致。第3 天時（圖7A），modSLA 組最高，約為SMO 組的1.8倍 （P<0.05），SLA 組約為SMO 組的 1.4 倍 （P<0.05），modSLA 組高于 SLA 組 （P<0.05）。第7天時（圖7B），各組之間差異無統計學意義（P>0.05）。2）BDNF mRNA的表達基本與蛋白表達一致。第3天時（圖7C），modSLA組最高，約為 SMO 組的 2 倍 （P<0.05），SLA 組約為 SMO組的1.7倍（P<0.05），modSLA組高于SLA組（P<0.05）。第7天時（圖7D），SLA組和modSLA組低于 SMO 組 （P<0.05），SLA 組和modSLA 組之間差異無統計學意義（P>0.05）。這表明，與SMO表面相比，modSLA、SLA表面可促進SCs早期NGF和BDNF mRNA表達，其中modSLA表面的促進作用更顯著。

3 討論

在牙科種植體中，純鈦材料的應用最為廣泛。大顆粒噴砂酸蝕是目前鈦種植體表面粗糙處理的常用方法。在此基礎上經過化學改性，進而形成親水性的化學活化大顆粒噴砂酸蝕表面。親水性表面處理不會形成氧化鈦膜，具有較高的表面自由能和潤濕性，同時避免了碳氫化合物的污染[10-11]。研究[12-13]證實，親水性表面可以加快血液吸附，吸引骨結合相關蛋白至微孔結構，加快間充質細胞分化為成骨細胞。目前國內外對于親水性表面的研究大多集中在成骨細胞和骨髓間充質干細胞等成骨相關細胞[14-15]。然而，親水性表面對于SCs和神經元的作用尚未明確。

圖 5 各組不同時間下SCs的增殖情況Fig 5 Cell proliferation of SCs of each group under different time

本實驗結果表明，3 種不同表面處理的種植體對于SCs 的黏附和伸展無明顯的影響；但是，3 種表面對SCs增殖、早期基因和蛋白表達的影響明顯不同。與SLA 和modSLA 表面相比，SMO 表面對于SCs增殖有明顯促進作用。此結果表明，對于純鈦材料而言，光滑表面比粗糙表面更利于SCs的增殖。而在神經營養因子（neuronotrophic factors，NTFs） 分 泌 方 面 ， 與 SMO 和 SLA 表 面 相 比 ，modSLA 表面更促進 SCs 早期分泌 NGF 和 BDNF，以及早期NGF 和BDNF 的基因表達。由此可以推斷，親水性表面比非親水性表面更利于早期NTFs的蛋白分泌和基因表達。這可能是因為大量的血清蛋白會吸附到親水性表面，對SCs的分泌功能起刺激作用，然而具體分子機制有待進一步深入研究。NGF 和 BDNF 是 SCs 分泌的 2 種重要 NTFs。研究表明，NGF 在體外和體內均能促進感覺神經元的存活和軸突生長[16]，而內源性BDNF是周圍神經損傷后神經再生和髓鞘再生所必需的生長因子[17]。

學者[18]探討了SCs 在機械加工、SLA、羥磷灰石涂層（hydroxyapatite-coated，HA）和鈦漿噴涂4 種鈦片表面的生長增殖及相關蛋白和基因表達情況，發現HA 涂層對于SCs 生物學功能的促進作用最顯著，認為可能與HA 涂層對蛋白質具有很強的吸附特性有關。關于神經元方面的研究，學者[19]在不同鈦片上培養大鼠背根神經元細胞，認為與機械加工和SLA 表面相比，電解刻蝕表面更有利于大鼠背根神經元細胞的黏附、細胞間的接觸以及細胞外基質的形成。另有學者[20]將胚胎大鼠大腦皮質神經元細胞接種于氧化鈦表面，并以玻璃爬片作為對照，發現神經元細胞的生長與分化在2組并無顯著差異，但是，神經突的延長在氧化鈦表面受到了明顯的抑制，樹突比軸突的抑制結果更明顯。不同種植體表面對SCs和神經元生物學行為的影響及其機制仍有待明確。

圖 6 各組不同時間下NGF和BDNF的表達Fig 6 Expression of NGF and BDNF of each group under different time

Wada 等[8]研究表明，種植體周圍再生的神經末梢數量在種植體植入后的第1周內逐漸增加。本課題前期動物體內研究[21]也發現，大鼠股骨種植體周圍神經纖維數量增加主要發生在種植體植入后的早期，同時這些神經纖維具有周圍神經纖維的典型結構，即神經軸突外有SCs完全包繞或者不完全包繞。這些組織學研究結果提示，種植體植入后的早期是種植體周圍神經再生的關鍵時期。研究不同因素，如種植體的表面處理、負載情況、種植時機等，對種植體周圍神經再生和外周神經傳導的影響，都應重點關注這一關鍵時期[22-24]。此外，神經軸突再生和SCs的生物學功能在種植體周圍神經再生過程中的作用不可替代，仍需進一步深入研究。

圖 7 各組不同時間下NGF和BDNF mRNA的表達Fig 7 Expression of NGF and BDNF mRNA of each group under different time

綜上，本研究表明，SCs 在3 種不同種植體表面都能良好地黏附、伸展、增殖、表達相關蛋白和基因。其中，SMO 表面對于SCs 增殖有明顯促進作用，而modSLA 表面對于SCs 早期NGF 和BDNF的分泌及基因表達有明顯促進作用。本研究證實了不同種植體表面性質對SCs的生物學行為影響具有差異。本研究為不同種植體表面性質對種植體周圍神經再生和外周神經傳導影響的體內研究提供了實驗基礎和依據。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。