低齡兒童齲病相關的唾液生化指標研究

張穎 賈松菠 李帆 李姍姍 張利娟 譚凱璇 盧潔 楊芳

1.青島大學口腔醫學院，青島266003；2.青島市市立醫院口腔醫學中心，青島266071；3.天津市兒童醫院口腔科，天津300074

低齡兒童齲（early childhood caries，ECC）是指小于71 個月的兒童，任何一顆乳牙上出現1 個或1 個以上的齲（無論是否成為齲洞）、失（因齲所失）、補牙面[1]。ECC 發病率高，根據我國第四次全國口腔衛生流行病學調查[2]，5 歲兒童齲病患病率為71.9%，其進展迅速且累及廣泛。乳牙齲損嚴重時造成咀嚼功能降低，影響兒童的營養攝入，并對頜面部以及全身的生長發育造成影響[3]。乳前牙的齲齒不僅影響美觀、兒童的正確發音，還給兒童心理造成一定的影響[4]。

唾液可以通過清除食物殘渣，利用碳酸氫和磷酸鹽緩沖液中和酸，維持牙齒礦物質的過飽和以降低釉質溶解速度以及參與獲得性生物膜的形成保護牙齒[5]；但其溫度、濕度、酸堿度以及口內特殊的解剖結構、物理化學性質等也能為致齲微生物群的生長繁殖創造有利的環境[6]。

傳統的齲病診斷方法包括視診、探診結合照射咬合翼片，而射線照相術、透照、電阻抗技術設備以及基于熒光的方法可以輔助齲齒檢測[7]。此外，現已建立了多個齲齒評分標準，包括基于視診標準評分的國際齲齒檢測評估系統-Ⅱ，基于激光的激光熒光齲齒診斷系統和基于光熱輻射測量和調制發光的Canary齲齒檢測系統[8]。可是，這些檢測和評估方法操作繁瑣，都需要患兒一定程度的椅旁配合，使齲病的診斷工作耗時費力。而本研究建立的齲病診斷和風險評估模型，基于唾液生化指標的檢測，無需兒童的椅旁配合，操作簡單易行；唾液樣本的收集過程簡便無損害，可以定期監測和評估齲病風險，能更方便、有效地區分齲病；通過檢測口腔唾液微環境，可能更接近齲病發生進展過程的探討，為ECC 的預防和治療提供依據。

1 材料和方法

1.1 采集對象的選擇

2018 年8—11 月對青島市5 所幼兒園兒童進行口腔檢查，納入標準：4~6歲兒童，其父母或其他監護人能提供知情同意，并且能夠配合取樣。排除標準：全身性或先天性疾病、發育畸形以及身體其他部位存在細菌或嚴重感染的兒童，在3個月內使用抗生素、氟化物和微生態調節劑以及口腔活動矯治器的兒童。

參考以往相關研究[9-10]，最終篩選出性別和年齡匹配的120 名4~6 歲兒童，分為低齡兒童齲病組[C 組：齲失補牙（the number of decayed, miss‐ing and filled teeth，dmft）指數>3]和健康兒童組（H 組：dmft 指數=0），每組各60 名 （其中男女人數的比例為1∶1）。整個試驗過程的細節和隨后的數據發表均經青島大學醫學倫理委員會批準，并征得兒童監護人同意。

1.2 樣本采集方法

口腔檢查：由3名兒童口腔專科醫生按照世界衛生組織推薦的《口腔健康調查基本辦法》進行檢查[11]，用dmft指數評估乳牙患齲狀態。檢查前經過培訓，并且檢查者間標準一致性檢驗結果良好（Kappa值>0.80）。檢查器械經過嚴格高溫高壓消毒滅菌，檢查者使用探針和口鏡在自然光下檢查乳牙患齲情況。

唾液收集：唾液樣本的收集在同一時間段（上午9∶00—10∶00）。兒童取樣的當天早晨不刷牙，收集前至少90 min 未飲水或進食。采樣時，兒童雙手掌放在大腿上，頭部稍微向下，略微向前彎曲，囑其持續5 min 把自然、未受刺激的唾液緩慢吐入50 mL無菌離心管中，進行編號并轉移至4 ℃保存箱直到收集結束，放置-80 ℃冰箱保存。

1.3 唾液樣本分析

唾液樣本自然解凍后在室溫下以10 000 r·min-1的轉速離心5 min，選取上清液，取2 mL唾液樣本進行檢測。

用電子pH計直接測定唾液pH值，首先用pH7緩沖液進行校準，檢測下一個樣品前將電極浸入蒸餾水，電極浸潤部分用濾紙擦拭干凈，并用pH7緩沖液校正再進行檢測。

利用酶標儀測定唾液總蛋白濃度，在595 nm處測定樣本的吸光度以得出唾液總蛋白濃度。

對于唾液離子濃度的測定，根據離子色譜儀的操作過程[12]測得峰面積和峰高度，首先配制淋洗液，然后檢驗標準品和樣品并進行數據處理，分別計算得出 Na+、K+、Cl?、PO43?、Ca2+、NO3?、NO2?、SO42?、F?、Br?、NH4+、Mg2+的濃度。

以上的所有檢測均重復3次。

1.4 數據分析

所有的統計分析采用R 軟件包（Version 3.6.1）進行。兩組間的生化指標以平均數±標準差呈現，采用Wilcoxon rank sum 檢驗比較兩組數值的差異，Person 相關系數評價生化指標與dmft 指數的相關性，以P<0.05表示差異具有統計學意義。

根據低齡兒童齲患者和口腔健康兒童唾液生化參數的差異，利用隨機森林（random forest，RF）算法基于全部唾液生化指標以及篩選出的5個具有顯著差異的潛在生化標記物，分別建立齲病診斷和風險評估模型。根據軟件包中的“rfcv”函數確定變量的特征重要性；將數據集隨機分為訓練集（90%）和測試集（10%），對RF 模型進行訓練，采用10 倍交叉驗證方法對結果進行評估，通過受試者工作特征曲線下面積（area under the receiver operating characteristic curve，AUC） 描述和量化模型的分類能力。

2 結果

2.1 2組唾液pH、總蛋白、離子濃度的比較

C 組和H 組間唾液生化參數的比較分析見表1。由表1 可見，C 組唾液樣本的NO3?濃度顯著低于 H 組，Cl?、Br?、NH4+、Mg2+濃度顯著高于 H 組（P<0.05）；而其余生化指標，較之H 組，如總蛋白、K+、PO43?、Na+、F?、SO42?、Ca2+濃度，在 C組增高，pH、NO2?濃度在C 組降低，但兩組間的差異無統計學意義（P>0.05）。

2.2 唾液生化參數與dmft指數的相關性

隨著dmft 指數的增加，NO3?的濃度顯著降低（r=?0.28，P<0.05；圖1A），Br?、Cl?、NH4+的濃度明顯增加 （r=0.39、0.39、0.33，P<0.05；圖1B、C、D）。

表 1 2組唾液生化指標的比較Tab 1 Comparison of salivary biochemical indices be‐tween 2 groups

圖 1 口腔唾液生化參數與dmft指數的關聯性Fig 1 Correlation between salivary biochemical indices and dmft index

2.3 基于唾液生化參數建立ECC的診斷模型

不同變量的重要性略有差別，在全部變量中，Cl?、NO3?、Br?、Na+、NH4+是對模型的建立具有較高貢獻的變量（圖2）；而將篩選出的5 個潛在齲病標記物對模型的重要性按照降序排列為：Cl?、NO3?、NH4+、Br?、Mg2+（圖3）。基于全部唾液生化參數信息建立的齲病風險評估模型（AUC=86.78%，圖4）與5 個篩選變量建立的模型區分ECC 和健康的性能基本相同（AUC=86.75%、圖5），都要高于85%，提示生化指標在鑒別低齡兒童齲的準確性和有效性方面具有較好的分辨率。

3 討論

唾液作為體內一種獨特的體液，包含至少99%的水，其余主要為電解質和蛋白成分。雖然電解質和蛋白只占唾液的一小部分，但對維持口腔健康和牙體完整具有重要作用。唾液的無機成分主要來自血液，它們的含量不是恒定的，常常以離子的形式存在。唾液中這些電解質的電解生物利用度在齲病中起著關鍵作用，通過碳酸氫鹽、磷酸鹽、尿素、兩性蛋白和酶實現緩沖和清除食物殘渣的作用[13]。Na+和K+等陽離子參與跨細胞膜的主動轉運，而陰離子Cl?可以激活α-淀粉酶，F?具有抗齲作用[14]。

首先，本研究的效力為80%，在95%置信區間和5%的誤差范圍內，至少需要100名參與者[15]，所以最終選取了性別和年齡匹配的120 名4~6 歲兒童進行樣本采集。通過比較ECC 患者和健康兒童唾液生化指標的差異，發現C 組的唾液NO3?濃度顯著低于H 組，并且與dmft 指數呈負相關，其他研究[16-17]也得出了類似結果。飲食中攝入的硝酸鹽通過主動運輸被集中到唾液腺，其濃度是血漿的10 倍[18]，硝酸鹽還原菌在厭氧環境下通過呼吸作用將NO3?還原為NO2?[19]，在齲病進展過程中，隨著厭氧菌和兼性厭氧數量的增加，更多的NO3?轉化為NO2?，所以與健康兒童相比，ECC患者唾液中的NO3?濃度顯著減少。然而，C 組兒童唾液中的NO2?濃度并沒有顯著增加，這是由于亞硝酸鹽不穩定，常作為中間產物，在酸的存在下易被分解為一氧化氮[20]。此外與H 組相比，C 組的pH 值略有降低，而差異沒有統計學意義（P>0.05）；有研究[10]表明，患齲兒童唾液pH 值顯著降低，當碳水化合物作用時，產酸細菌通過糖酵解作用降低酸堿度，導致齲齒表面脫礦[21]。這可能是由于選取的兒童飲食習慣以及取唾液樣本時間的差異造成的，而齲病是一種多因素疾病，微生物、飲食和食物都可能影響唾液的緩沖能力導致pH值改變。

圖 2 基于全部生化參數建立的模型變量的重要性分布Fig 2 Importance of variables in the model based on all biochemical parameters

圖 3 基于5個篩選參數建立的模型變量的重要性分布Fig 3 Importance of five variables in the model based on selected parameters

其次，C 組 Cl?、Br?、NH4+、Mg2+濃度顯著高于H組，其中Cl?、Br?、NH4+濃度與dmft指數正相關。保持牙齒的完整性是唾液的功能之一，牙齒暴露在唾液環境中，其表面形成的唾液蛋白膜起到屏障作用，減少牙齒表面的脫礦[22]。釉質主要由無機物組成，包括羥磷灰石晶體，少量氟磷灰石以及鈉、鉀、鎂、氯等元素。一旦齲病發生，隨著口腔內H+水平的升高，牙齒礦物質脫礦溶解，溶解的 Ca2+、Na+、K+、Mg2+、Cl?和 PO43?從牙齒結構擴散到牙齒周圍的唾液中[23]。因此，與健康兒童相比，ECC 患者唾液中上述離子增高，其中Cl?、Mg2+具有顯著差異。離子濃度越高，說明牙齒中礦物成分的溶解程度越高。

本研究發現，兩組的總蛋白含量無顯著差異，在C組中略有增高，與既往研究[24]的結果相似，然而也有研究[10]發現，患齲兒童唾液中總蛋白含量顯著高于健康兒童。總蛋白含量在患齲兒童唾液中增加，可能是因為抑菌蛋白成分如溶菌酶、乳鐵蛋白、唾液過氧化物酶等抗氧化劑的增加，但唾液中又有一些蛋白如黏附素和凝集素，是通過增加微生物的定植發揮有害作用的[25]。而Ca2+、PO43?濃度在C 組較高，但無差異，與以往研究[26]不完全一致，其不同之處可能在于離子濃度的測量方法，以往用鄰甲酚酞絡合劑和自動磷鉬酸鹽/紫外分光光度法在半自動分析器儀比色測定。而在本研究中，唾液樣品的離子濃度都是用離子色譜儀分析的，離子色譜操作簡單、精確度高、分析速度快，在靈敏度、操作、成本等多方面都具有明顯優勢[27]。

圖 4 基于全部唾液生化參數建立的ECC風險評估模型的性能圖Fig 4 Performance of ECC risk assessment model based on all salivary biochemical parameters

圖 5 基于5個篩選參數建立的ECC風險評估模型的性能圖Fig 5 Performance of ECC risk assessment model based on five selected parameters

最后，唾液的生化標記物對有機體至關重要，在很多疾病的預防和治療中發揮著重要作用。作為模型中最重要的變量，Cl?在維持電中性方面起著重要作用，其濃度顯著影響了上皮細胞液體的分泌或吸收速度[28-29]。Mg2+可以作為羥磷灰石礦物組分的取代基，也有助于Ca2+和K+通過細胞膜的運輸[30]，并且Mg2+通過減少細菌毒性因子導致的炎癥反應，在預防牙周疾病和齲齒中發揮了重要作用。而銨鹽可以中和酸，提高口腔環境的pH，由作為緩沖物質存在于唾液中的尿素被牙菌斑代謝后產生，并且可能由于口腔內的反饋調節，使患齲兒童口腔內NH4+濃度補償性升高。

本研究基于唾液全部生化信息和篩選出的5個齲病相關離子，分別建立了ECC 風險評估模型，區分ECC 患者和口腔健康者的準確度可達85%以上。AUC 值越接近1，提示模型的診斷性能越好。篩選出的5個參數的齲病評估模型與基于全部唾液參數的齲病評估模型性能相似，提示利用這5個離子參數就可以快速、準確區分ECC 患者和健康人群，并且唾液生化參數對于ECC 的診斷和風險評估具有應用潛能。因此，唾液中豐富的無機離子可能是口腔微生物的最終代謝產物，對建立準確而便捷的齲病診斷和風險評估具有重要意義。

本課題組在后續的研究中將通過追蹤觀察，研究唾液中這些理化參數的水平變化能否先于臨床癥狀的表現，將其作為預測兒童患齲的有力指標，為這些兒童制定個性化的預防計劃。并且，本研究強調了生化指標對于診斷ECC 的可行性，那么這些參數指標能否普遍適用于不同年齡組的人群以及其他類型的口腔感染有待進一步研究。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。