美洲大蠊的生藥學及分子生藥學鑒定

蘇陽，徐凌川

(山東中醫藥大學 藥學院，山東 濟南 250355)

美洲大蠊PeriplanetaamericanaL.為昆蟲綱有翅亞綱蜚蠊目蜚蠊科大蠊屬昆蟲[1]，俗名“蟑螂”。始載于我國的第一部藥物學專著——《神農本草經》，位列蟲獸部中品，始稱“蜚廉”[2]，李時珍《本草綱目》中亦錄有別名石姜、負盤、滑蟲、茶婆蟲、香娘子等。其味咸、寒、有毒，主治血瘀、癥堅、寒熱、喉咽痹、內寒無子，有下氣、利血脈、破積聚的功效[3-7]。美洲大蠊用藥歷史悠久，現已被云南、湖南等多省藥材標準單獨收錄[8-9]。近年來，美洲大蠊的研究熱點多側重于其化學成分和藥理作用，發現其主要成分為信息素、氨基酸和各種昆蟲神經肽[10]，具有抗腫瘤、抗病毒、促進組織復生、鎮痛、抗炎以及保護心血管方面的作用[11-15]，以美洲大蠊為原藥的康復新液、心脈隆注射液、肝龍膠囊等中藥制劑現已在臨床應用[16]。

中國已知蜚蠊種類近300種[17]，美洲大蠊常以干燥蟲體為中藥原料，隨著其臨床應用日益廣泛，市場上出現了不少與美洲大蠊形態相似的品種，如德國小蠊Blattellagermanica和雄土鱉EupolyphagasinensisW.，存在摻假銷售現象。鑒于此，本文對美洲大蠊的外觀形狀特征進行了詳細描述。又因美洲大蠊常以粉末形式在網上銷售，本文將對其粉末進行生藥學和分子生藥學鑒定，為該藥材的質量控制提供參考依據。

1 材料

1.1 儀器

Stemi 305高效體視顯微鏡(德國卡爾·蔡司公司)；PH100-DB500U-IPL生物數碼顯微鏡，鳳凰PHMIAS2008圖像處理軟件(江西鳳凰光學股份有限公司)；5424R臺式離心機 (德國 Eppendorf)；ABI 3730xl DNA 測序儀(美國 ABI 公司)；Bio-Rad 伯樂ChemicDocTM XRS+凝膠成像系統(美國伯樂公司)；B960 PCR儀(杭州晶格科學儀器有限公司)。

1.2 藥品與試劑

美洲大蠊干燥蟲體，采購于濟南市長清區魯明生態養殖園，經山東中醫藥大學生藥學教研室徐凌川教授鑒定為蜚蠊科大蠊屬昆蟲美洲大蠊PeriplanetaamericanaL.的干燥蟲體。德國小蠊B.germanica和雄土鱉E.sinensis誘捕于山東中醫藥大學長清校區，經烘干法得干燥蟲體。石油醚、水合氯醛、丙三醇均為分析純(天津市科密歐化學試劑有限公司)，蒸餾水(山東中醫藥大學實驗中心)。OMEGA動物組織提取試劑盒(批號D5625-01) ，EasyTaq Buffer(批號M20833) EasyTaq聚合酶(批號 M20823)，dNTP Mixture (批號M20805) 和DNA Marker(BM2000+1.5k， 批號L61023)，CO1引物(批號180810B52、18081B53，均購于北京全式金生物技術有限公司，測序由山東省農業科學院生物中心分子測序中心完成。

2 方法

依照《中國藥典》2015年版一部中藥材粉末鑒定方法[18]，將藥材樣品粉碎，再對藥材粗粉用石油醚脫脂處理，揮干醚液，過4號篩(65目篩)后，混合均勻[19]。取粉末少許至載玻片上，分別用水合氯醛溶液、稀甘油、蒸餾水裝片后置于生物顯微鏡下觀察粉末顯微特征，并用顯微鏡配備的鳳凰PHMIAS2008圖像處理軟件對粉末特征進行圖像采集以及測量分析[20]。

DNA提取及序列擴增采用OMEGA動物組織提取試劑盒(以下簡稱試劑盒)，具體實驗操作參考使用說明書。昆蟲種屬鑒定是基于線粒體細胞色素C 氧化酶亞基1 (CO1)的DNA 條形碼[21]。

PCR反應總體系為25 μL，其中EasyTaq聚合酶0.25 μL， 10×EasyTaq Buffer 2.5 μL， dNTPs(2.5 μmol·L)2.0 μL，上、下游引物各 1.0 μL(10 μmol/L)，DNA 模板2.0 μL(20～50 ng/L)，無菌超純水補足至 25 μL。PCR擴增上游引物LCO1490:5'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3' HCO2198:5'-TAAACTTCAGGGTGACCAAA AAATCA-3'進行PCR擴增[22-24]。

PCR反應程序為94 ℃ 1 min、94 ℃ 1 min、45 ℃ 1.5 min、72 ℃ 1.5 min，5個循環；94 ℃ 1 min，50 ℃ 1.5 min，72 ℃ 1 min，35個循環；72 ℃ 5 min。取5 μL PCR產物利用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增效果。測序由山東省農業科學院生物中心測序中心完成。數據處理：測序峰圖利用Seq Man、CodonCode Aligner V等軟件進行基因序列拼接整理，獲得CO1序列。并與GenBank收錄的美洲大蠊的CO1基因序列進行相似性對比。通過DNA條形碼檢測傳統鑒定學的準確性。

3 鑒別

3.1 性狀鑒別

美洲大蠊干燥蟲體呈類卵圓形，赤褐色，頭部略平窄尾部寬。整體長27～32 mm，寬9～27 mm，厚度6～10 mm，雌體比雄體微大[25]。前胸背板略作梯形，中部有一赤褐以至黑褐蝶形斑，中線前緣有黃色“T”形小斑，后緣緩弧形。雄體腹部各節背板后側角為直角，鈍圓，雌體后端數節向后略突出。翅發達，雄體翅超出腹端，雌體翅伸至腹端。雄體肛上板橫寬，半透明，后緣有較大的三角缺口，腹部第一背板無毛茸；雌體肛上板略呈長三角形，不透明，后緣呈三角形切口。足三對，下足露于蟲體外。體較輕，質脆易折斷，氣腥，味微咸。

蜚蠊形態大小有差異，歷代本草中均有記載，基本可從其大小、形狀和顏色等方面與正品進行區分。市場上常見美洲大蠊混淆品主要是德國小蠊和雄土鱉。現代性狀鑒別多結合其前胸背板形狀、翅膀形狀及其氣味等特點進行鑒別。鑒別要點見表1。

表1 美洲大蠊及市面上常見偽品的性狀鑒別要點

3.2 顯微鑒別

美洲大蠊粉末顯微實物圖見圖1。

注：A—體壁碎片；B—橫紋肌碎片；C—粗剛毛；D—細剛毛；E—復眼碎片；F—翅膀碎片。圖1 美洲大蠊粉末顯微實物圖Fig.1 Micrograph of P. americana powder

3.2.1 體壁碎片

黃色或黃棕色[26]體壁碎片，具網狀紋理，有時可見類圓形壁孔，壁孔邊緣顏色變深；黃棕色或淡黃色體壁碎片，具類六邊形或魚鱗狀紋理；黃棕色體壁碎片，表面平滑而附有虛線白點狀紋理，偶見透明類圓狀毛窩；黃棕色或黃褐色體壁碎片，表面常見圓點狀毛窩；淺黃色或無色具魚鱗狀突起的體壁碎片；淺黃色或無色體壁碎片，表面圓凸，密布細短的剛毛；部分體壁碎片有明顯的內外壁分層，外壁折斷后突顯出色淡或無色的內壁。

3.2.2 橫紋肌

橫紋肌纖維常見[27]，棕黃色或無色透明，橫紋排列細密，有時或交叉、或垂直、或螺旋狀散在。

3.2.3 剛毛

剛毛有粗細兩種[28]。粗剛毛：常見，長圓錐形，平直或略彎曲，深棕色或棕褐色，長96～217 μm，中段直徑14～31 μm，多斷裂；基部呈類圓形，略膨大，后向上略有凹陷；中段顏色加深；頂端鈍圓，顏色與基部顏色大體一致；于高倍鏡下觀察，剛毛全體自基部凹陷處以上開始，附著有緊貼表面且尖部朝上的寬扁形毛刺，延伸至剛毛頂端時，毛刺逐漸變圓，呈膨弧狀，有時可見毛刺間的溝壑；髓腔發達，基本貫通剛毛全體，基部腔體直徑可達總直徑的一半，腔內中空或殘留黑色毛髓。細剛毛：常見，披針形或針形，平直或稍彎曲，黃色或黃棕色，長80～317 μm，中段直徑4～12 μm，多自基部斷裂；完整者可見基部略膨大形似鉚釘；頂端尖銳；表面平滑，無紋理；髓腔細長通透，無髓質。

3.2.4 復眼碎片

復眼碎片少見，單眼[29]呈正六邊形或類圓形，中央白凈，各單眼相交邊緣呈磨砂粒感的暗灰色。

3.2.5 翅膀碎片

翅膀碎片偶見，黃綠色或淺黃色，表面有鱗狀或波紋狀的紋理密布。

3.2.6 脂肪油滴

脂肪油滴[30]常見，黃色或淺黃色，略顯透亮，類圓形或類橢圓形，單個或聚集成團狀散在。

3.2.7 常見偽品顯微特征

德國小蠊與美洲大蠊的體壁碎片及其他碎片顯微觀察未見明顯差異，兩者主要差異在于剛毛的疏密程度。美洲大蠊剛毛多斷裂散在分布，位于體壁上的剛毛分布較密，而德國小蠊體壁剛毛分布稀疏。雄土鱉粉末呈深棕色至褐色，與前兩者顏色相比，視野下粉末顏色明顯加深，差異明顯，可作為顯微鑒定的區分項。另外，雄土鱉偶見表面具刺突的剛毛，是其特有剛毛類型。

3.3 PCR擴增及序列分析

以提取的美洲大蠊待測樣本基因組DNA為模板，采用DNA條形碼中的動物通用引物CO1進行PCR擴增，利用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結果。用DNA Marker D(100～2000 bp)檢測擴增片段DNA長度，以確保擴增結果有效。在紫外光下觀察可擴增出一條明顯的特異性條帶，與Marker區間對比，DNA長度為700 bp左右(圖2)，結果說明PCR擴增結果可用。將測序所得序列進行拼接及人工校對，去除低質量序列及引物區。經雙向測序、拼接，所得序列片段長度與PCR擴增結果基本一致。用NCBI GenBank進行在線BLAST比對，與P.americana的CO1序列匹配度都很高，同源性100%，表明擴增和測序結果準確可靠，分子生藥學方法能夠準確鑒別美洲大蠊正品。

注：1—空白；2～4—美洲大蠊樣品；M—DNA Marker。圖2 CO1基因片段擴增結果Fig.2 Amplification results of CO1 gene fragment

4 結論與討論

美洲大蠊蟲體卵圓形，前胸背板近梯形，前胸背板中部的蝶形斑，是其區別于偽品的顯著特征。雄性美洲大蠊翅膀較長超出腹端，雌性與腹端齊平。從顯微鑒別特征來看，美洲大蠊剛毛有粗細兩種，粗剛毛常見，長圓錐形，基部略膨大，向上逐漸凹陷，頂端鈍圓，髓腔發達貫穿全體，偶見黑色髓質。不同部位蟲體碎片略有差別，多具網狀或鱗狀紋理。對不同批次的美洲大蠊顯微鑒別結果表明，美洲大蠊不同部位的顯微特征不同，相同顯微鑒別特征可能分布在不同部位，其碎片和剛毛可作為區分其他粉末的主要依據。結合分子鑒定，說明該生藥學鑒定方法可以準確鑒定美洲大蠊。現有的資料對美洲大蠊及其常見偽品的鑒別報道很少，本文首次將美洲大蠊與市面上常見偽品德國小蠊及雄土鱉進行鑒別，所以鑒定結果的準確性有力地保障了質量控制方面的進一步研究。

該實驗對美洲大蠊中藥材粉末鑒定的前期處理做了優化。在實驗初期，未對美洲大蠊粉末進行脫脂處理，發現顯微視野下粉末的脂肪油滴過多，對實驗的正常觀察造成了不小影響。而脫脂后的美洲大蠊的粉末，在顯微鏡下特征明顯，顏色分明，使實驗達到了預期的效果。美洲大蠊粉末碎片種類較多，觀察起來較為繁瑣，針對于此種情況，實驗中分別將美洲大蠊翅膀、腹部、頭部、胸部粉碎后各自觀察。在記錄特征之后，再對美洲大蠊全身的粉末進行顯微鑒別。用此種方法可以較系統全面地識別美洲大蠊粉末的顯微特征，快速將其與其他粉末區別。實驗過程中還發現，對于經水合氯醛透化制成的臨時裝片，實際的觀察效果不如水合氯醛、甘油或蒸餾水的冷裝片效果好。所以建議觀察美洲大蠊粉末前，先將粉末進行脫脂處理，再冷裝片觀察。形態學鑒定在中藥鑒定學研究中仍普遍適用，且短期之內其方法不會被取代。由于CO1基因片段保守性強, 適于親緣關系較近的昆蟲分子系統研究，故本實驗未對其全部種類進行分子鑒定。本次實驗，筆者總結了美洲大蠊的性狀及其粉末顯微特征和分子鑒定結果，希望可以為鑒別美洲大蠊提供參考資料。

美洲大蠊作為傳統藥用昆蟲，在抑菌和促進傷口愈合方面效果顯著，對增強心臟功能、治療肝炎和肝纖維化也有作用。目前，云南、四川和山東等地人工養殖美洲大蠊初具規模，市面上開發出了以美洲大蠊為原料的復方制劑，以其為中心的產業鏈已具雛形。美洲大蠊中藥劑型的品質和其粉末的質量關系密切[31]，但就目前而言，基礎研究仍有不足，下一步應該加強質量控制方面的研究，將更多品質更佳的美洲大蠊投入市場。