固相萃取-高效液相色譜-串聯質譜法分析環境水樣中5種酚類化合物

劉友彬，李玉陽，李燕*

(1. 濟南大學 化學與化工學院，山東 濟南 250012；2. 山東省化工研究院，山東 濟南 250014)

作為重要的高分子化工原料，酚類化合物(雙酚類和烷基酚類)廣泛應用于各個領域。在我們的日常環境中，酚類化合物會以微量或者痕量的水平存在，其理化性質較為穩定，不易降解，因此會在環境中長期存在，產生潛在的危害風險，并通過食物鏈等各種途徑污染環境水源等介質，最后進入人體，影響人體代謝生理平衡，進一步引發疾病[1-2]。因此建立環境水樣中此類物質的分析測定方法，對考察環境水體中酚類化合物的含量及保護人類健康有重要的意義。

目前，報道較多的關于此類物質的測定方法有氣相色譜法[3]、液相色譜法[4]、氣相色譜-質譜法[5]、液相色譜-質譜法[6]、毛細管電泳法、酶聯免疫吸附測定法等。氣相色譜和液相色譜分析時間較長；氣相色譜-質譜聯用法測定雙酚類物質需要衍生化步驟，過程較為繁瑣；液相色譜-質譜聯用法是利用液相色譜作為質譜進樣系統，使復雜的化學組分得到分離，再利用質譜作為檢測器進行定量分析，準確性和靈敏度優勢明顯；毛細管電泳法、酶聯免疫吸附測定法主要用于單種酚類物質的分析。高效液相可以縮短色譜分離時間，和質譜法聯用進一步提高了準確性和快捷性。環境水樣中酚類化合物含量較低，會增加樣品的檢測難度，再者就是樣品基體會比較復雜，可能存在一些干擾，也會影響樣品的萃取效果，所以對樣品進行預處理顯得格外重要。

目前關于酚類化合物的樣品前處理技術主要有液-液萃取、分散液-液萃取、微波輔助提取萃取、固相萃取、基質輔助固相萃取、快速萃取試劑盒等。固相萃取(solid-phase extraction, SPE)是使用固定相吸附劑對液體樣品中的目標物進行萃取，從而使目標物脫離樣品的基體和干擾物，然后再用洗脫液洗脫，達到分離和富集目標物的目的[7]。作為一種重要的前處理手段，有著操作簡便、準確、快速及便于實現自動化等優點，廣泛應用于食品、醫藥和環境等領域。

目前很多方法主要集中在對單個雙酚類物質的測定，同時測定水中多種雙酚類化合物的報道較為少見。本文以環境水體為研究對象，分別對固相萃取條件(pH、樣品流速、洗脫劑種類、洗脫劑用量)、質譜條件(質譜離子源、監測反應模式)、色譜條件(流動相的比例)進行優化，建立了全自動固相萃取-高效液相色譜-串聯質譜法。該方法可同時分析5種酚類化合物，即雙酚A(BPA)、雙酚F(BPF)、雙酚S(BPS)、n-壬基酚(NP)、n-辛基酚(OP)。本方法可為環境水中酚類化合物的定性定量分析提供技術保障，亦可為其他樣品中酚類化合物分析提供借鑒。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

超高液相色譜-電噴霧串聯質譜儀(Agilent 1260+6460B QQQ)；固相萃取儀(Dionex SPE-280)；氮吹濃縮儀(Biotage)；超純水制備儀(Millipore Milli-Q Integral15)；色譜柱Thermoforms C18(2.6 μm, 2.1 mm×100 mm) (Thermoforms)。

BPA(標準品，純度不低于99.9%)； BPF(標準品，純度不低于99.9%)； BPS(標準品，純度不低于99.9%)； NP(標準品，純度不低于99.9%)； OP(標準品，純度不低于99.9%)；乙腈(色譜純)；乙酸銨(分析純)。

1.2 樣品的采集與保存

樣品采集根據《水質采樣技術指導》[8]要求的方法操作，用4 L棕色玻璃瓶采集每個點位的樣品。樣品須在4 ℃冰箱冷藏保存，并在24 h內進行分析測試。

1.3 樣品前處理

預先用6 mL甲醇，達到去干擾和活化固相萃取柱(Waters, cc 500 mg)的目的，再用6 mL純水通過小柱條件化。采集1000 mL水樣，加入硫酸調節pH為6左右，以10 mL/min流速通過活化的固相萃取柱，完成固相萃取富集。加入10 mL純水，然后抽空氣30 min，加入10 mL二氯甲烷/乙腈洗脫，將洗脫液氮吹干，用1 mL乙腈/水定容，待測。

1.4 儀器條件

圖1 酚類化合物的色譜圖Fig.1 Chromatogram of phenolic compounds

質譜實驗條件：采用電噴霧離子源(ESI)負離子模式監測，監測模式采用多級反應監測模式(MRM)。毛細管電壓為4.0 kV，離子源溫度為500 ℃，氣簾氣(CUR)壓力為40 psi(1 psi=6895 Pa)，噴霧針電壓為-4500 V，噴霧氣(GS1)壓力為55 psi，碰撞氣(CAD) 壓力為Medium，目標掃描時間為0.1 s，入口電壓(EP)為10 V，出口電壓(CXP)為13 V，脫溶劑溫度350 ℃，氮氣流速480 L/h。各化合物的質譜條件見表1。

表1 酚類化合物的質譜條件

2 結果與討論

2.1 固相萃取條件優化

為了得到最優的實驗條件，分別對萃取條件如pH、樣品流速、洗脫劑種類、洗脫劑用量進行探討和優化。用樣品的回收率來表征實驗條件的優化，其計算如下式：

(1)

pH是影響樣品萃取效率的重要參數之一，pH的大小與水樣中化合物的存在狀態有很大關系。我們考察了樣品的pH分別為2、4、6、8、10時，對酚類化學物萃取效率的影響，見圖2。當pH為2～6時樣品的回收率逐漸增大，當pH=6時，可以看出5種酚類化合物的回收率最高；當pH為6～10時，樣品的回收率逐漸降低。可見pH過高或過低都會影響樣品的回收率，因此，選擇pH為6作為最佳的pH條件。

圖2 pH對酚類化合物萃取效率的影響Fig.2 Effect of pH on extraction efficiency of phenolic compounds

樣品流速的大小是考察固相萃取過程中目標物能否有效富集的重要因素，實驗研究了樣品流速在2、4、6、8、10 mL/min時的萃取效果。由圖3可以看出，當流速在2～6 mL/min時，樣品的回收率隨著流速的增大而提高。當流速在6～10 mL/min時，回收率隨樣品流速增加而降低。可能流速過大，不能保證樣品的目標物在固定相匯總從而有效保留。為了達到更好的萃取效果，采用6 mL/min作為最佳樣品流速。

圖3 樣品流速對酚類化合物萃取效率的影響Fig.3 Effect of sample flow rate on the extraction efficiency of phenolic compounds

作為影響固相萃取效果的重要參數，洗脫液的種類在實驗優化過程中也是必不可少的。當把兩種不同的極性物質放在一起時，除了各自分子間存在著取向力外，兩種不同分子間還存在著取向力，因此兩種不同的極性物質可以相互混溶，即“相似相溶”原理。我們考察了常用的有機溶劑，包括甲醇(1)、乙腈(2)、丙酮(3)、甲醇/二氯甲烷(4)和乙腈/二氯甲烷(5)5種溶液作為洗脫液的萃取效果，由圖4可以看出，乙腈/二氯甲烷的洗脫能力明顯高于其他4種洗脫液。因此，選擇乙腈/二氯甲烷作為本實驗的洗脫液。

圖4 洗脫劑種類對酚類化合物萃取效率的影響Fig.4 Effect of eluent type on the extraction efficiency of phenolic compounds

洗脫劑的用量同樣會影響SPE的效率，考察了洗脫劑用量在2、4、6、8、10 mL時的萃取效果，見圖5。在2～6 mL范圍內，隨著洗脫劑用量的增加而增加。當洗脫劑的用量繼續增大時，回收率基本不變。因此，選擇6 mL洗脫劑作為最佳洗脫劑用量。

圖5 洗脫劑用量對酚類化合物萃取效率的影響Fig.5 Effect of eluent content on the extraction efficiency of phenolic compounds

2.2 色譜條件的優化

液相色譜分析中，流動相的組成不僅影響目標物的色譜峰型和分離效果，且直接影響檢測器的響應值和檢測靈敏度。考察了乙腈-水、甲醇-水、乙腈-5 mmol/L乙酸銨、甲醇-5 mmol/L乙酸銨4種流動相體系對5種化合物的分離效果。以信號響應值、峰型和干擾程度作為評價效果的依據。與甲醇-水相比，甲醇-5 mmol/L乙酸銨、乙腈-5 mmol/L乙酸銨為流動相時，待測物的響應值更高，提高了待測組分分離度。與乙腈-水相比，乙腈-5 mmol/L乙酸銨為流動相時，對同一標樣，各化合物的回收率在85%～115%，可以看出在該流動相下的目標物的離子化效果更好; 5種化合物的色譜峰均沒有拖尾或者前展寬的現象，峰型更好；靈敏度更高。主要原因是由于甲醇和目標酚類間存在一定的氫鍵作用，所以色譜圖存在不同程度的拖尾現象，乙酸銨的加入改善了這種拖尾現象，而目標物在乙腈存在的條件下可以提高信號響應強度。因此，采用乙腈-5 mmol/L乙酸銨為流動相。

2.3 質譜條件的優化

多級反應監測模式質譜條件的優化主要包括監測離子模式、定量和定向離子選擇及儀器參數的設置。優化質譜條件的目的是為了找出保留時間和分析物峰之間的最佳分辨率，使樣品中每種物質的離子化效率達到最佳。采用負離子模式測定酚類化合物時，因為每種化合物自身帶有羥基，容易去質子化，形成負離子峰，因此選用負離子模式定量檢測。用針泵進樣100 μg/L的BPF、BPS、BPA、NP和OP的混合溶液，在負離子模式下進行全掃描以選擇適當的電離方式和分子離子峰。根據目標化合物的理化性質，選取ESI作為電離源。實驗中，以5種物質的分子離子為基礎，采用子離子掃描方式選擇最優的兩特征離子確定化合物的定量離子和定性離子，并優化碰撞電壓(CE)、去簇電壓(DP)使子離子的強度最大。配制5種物質的混標，以多反應監測(MRM)方式優化霧化氣(GS1)、輔助氣(GS2)、氣簾氣(CUR)、碰撞氣(CAD)、離子源電壓(IS)、離子化溫度(TEM)等質譜參數(表2)，使樣品中每種物質的離子化效率達到最佳。根據母離子與豐度高、干擾小的兩個子離子形成的離子對分別進行定性、定量分析。

表2 酚類化合物的質譜條件優化結果

2.4 方法建立

本方法使用外標法定量。用初始流動相稀釋并配制濃度分別為1、5、10、25、50、100、250、500 μg/L BPA、BPS、BPF、NP和OP標準系列。按照濃度從小到大的順序，依次上機測定，標準曲線通過濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標繪制，進一步得出線性方程和回歸系數。通過重復7次空白實驗計算得各組分最低檢測濃度，依據HJ168—2010[9]要求計算最低檢出限和方法定量限，得出方法定量限，結果見表3。由表3可知，5種酚類化合物在一定范圍內呈現良好的線性關系，相關系數范圍為0.997 9～0.999 7，滿足定量分析的需求。

表3 各目標物的線性方程、相關系數、方法檢出限和定量限

選擇一種類型已知且目標物未檢出的環境水樣(如地下水)進行前處理。對每類水樣分別選取高、中、低3個濃度進行加標實驗，按全程序經固相萃取富集后測定，每個樣品平行測定5次，計算不同濃度水平樣品的相對標準偏差、加標回收率等參數。由表4可以看出，方法的精密度在2.54%～7.88%，回收率在89.40%～104.20%，說明該方法可行。

表4 各目標物的相對標準偏差和回收率(n=5)

和已有文獻中酚類化合物檢測方法比較，結果如表5所示。本文方法使用高效液相色譜和質譜聯用，提高了目標物的靈敏度。該方法檢出限更低，精密度良好，回收率較好，準確度高，另外分析時間(5 min)較短，節約了儀器測試時間。上述結果表明，本實驗建立的方法適用于水中多種酚類化合物的分析。

表5 環境水樣中酚類化合物檢測方法對比

2.5 樣品分析

采集4種類型的環境水樣進行實際樣品分析，按全程序經固相萃取富集后測定，每個樣品平行測定5次，其中地表水樣品色譜圖見圖6(a)，BPA處的質譜圖見圖6(b)。由表6可以得出，地表水檢出BPA含量為1.06 ng/L，其余樣品中均未檢出目標物。

圖6 地表水樣品色譜圖和質譜圖Fig.6 MRM chromatogram and MS of surface water

表6 環境水樣中各目標物的分析結果(n=5)

3 結論

本文建立了環境水樣中5種酚類化合物的固相萃取-高效液相色譜-串聯質譜的分析方法。5種酚類化合物的檢出限為0.05～0.15 ng/L，定量限為0.20～0.65 ng/L，方法的精密度在2.54%～7.88%，回收率在89.40%～104.2%。該方法準確可靠，可以為環境水樣中酚類化合物的污染特征和分布規律研究提供相應的方法依據，也可以為后續國家相關標準的建立提供參考。