乏氧誘導的miR-210表達通過BDNF/NF-κB/自噬信號途徑促進成纖維細胞存活

劉琦 林峰

(上海市第八人民醫院腫瘤科，上海 200235)

乏氧是一種細胞供氧不足的狀態，發生在各種組織損傷中，包括缺血再灌注損傷、肺損傷、輻射誘導的正常組織損傷[1]。有研究報道，放射性后組織乏氧可加重放射性直腸損傷的發生[2]。乏氧可誘導活性氧(ROS)的產生，導致氧化應激，進而導致DNA、脂質和蛋白質損傷[3]。此外，ROS可激活氧化還原信號通路，導致內皮細胞死亡，誘導組織炎癥和加重組織損傷[4]。然而，乏氧誘導細胞損傷的確切機制尚不清楚。microRNAs(miRNAs)是一種內源性、短的、非編碼的RNA，能夠結合靶基因mRNAs的3′-UTR，通過mRNA降解或抑制翻譯在轉錄后水平抑制靶基因的表達[5]。有研究[6]表明miRNA-210可以通過下調乏氧條件下Bcl-2的表達降低結腸癌細胞的放射敏感性。本研究探討乏氧條件下miR-210對成纖維細胞存活的影響。

1 材料與方法

1.1一般資料

1.1.1細胞系和培養條件 將人類皮膚成纖維細胞GM0639細胞在Dulbecco改良的Eagle′s培養基(法國Biowest)中培養。在三氣培養箱(YCP-50S，長沙華西電子技術有限公司，中國)中于37°C，5%CO2，93%N2和2%O2的條件下進行乏氧處理。

1.1.2RNA分離和實時定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR) 使用TRIzol試劑(RNAprep Pure Cell/細菌試劑盒，天根，北京，中國)分離總RNA。miR-210逆轉錄引物序列：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTC AGCC-3′。所使用的實時PCR引物序列如下：miR-210 5′-CTGTGCGTGTGACAG-3′和miR-210反義序列，5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；U6 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′和U6反義序列5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′; HIF-1α 5′-CGTTCCTTCGATCAGTTGTC-3′和HIF-1α反義序列，5′-TCAGTGGTGGCAGTGGTAGT-3′;BDNF5′-GAGCTGAGCGTGTGTGACAG-3′和BDNF反義序列5′-CTTATGAATCGCCAGCCAAT-3′。

1.1.3Western blot 用Pierce BCA蛋白測定試劑盒(ThermoFisher，MA，USA)進行蛋白濃度定量。通過在10%(w/v)聚丙烯酰胺凝膠上的SDS-PAGE分離等量的蛋白質提取物，然后轉移到BioTraceNC膜(美國紐約州Pall)上。用封閉緩沖液(5%(w/v)牛血清白蛋白，0.1%(w/v)Tween 20磷酸鹽緩沖液)封閉1 h。用于western blot的抗體如下：抗HIF-1α(Epitomics，CA，美國)，NF-κB/p-NF-κBp65(Epitomics)，抗LC3(Medical&Biological Laboratories Co.，Ltd.(日本)和抗BDNF(英國Abcam)，辣根過氧化物酶偶聯的第二抗抗兔抗體(Millipore，MA，美國)或抗小鼠抗體(Genetex，TX，USA)。使用ECL印跡檢測試劑(ThermoFisher)檢測，并使用Chemioscope Mini系統(ChemiQ 4800 Bioshine，中國)進行成像。

1.2檢測方法

1.2.1凋亡檢測 PBS洗滌細胞兩次，在37℃下離心5 min，并重懸于結合緩沖液中。然后，使用膜聯蛋白V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(BD Bioscience，NJ，美國)和碘化丙錠(BD Bioscience)對細胞染色。然后使用流式細胞儀(FC500 MPL，貝克曼庫爾特，CA，美國)分析染色的細胞。

1.2.2ROS生成測定 將細胞在乏氧條件下培養24 h和48 h，然后與2,7-二氯二氫熒光素二乙酸酯(20 mM)(DCF-DA； Beyotime Biotechnology，中國)在黑暗中孵育20 min。然后，將細胞懸液在室溫下離心5 min，并除去上清液。使用流式細胞儀(FC500 MPL，Beckman Coulter)測量和計算DCF-DA的熒光強度，進行ROS檢測。

1.2.3自噬檢測 用PBS洗滌細胞兩次，然后在37℃下離心5 min，并重懸于結合緩沖液中。使用Cyto-ID自噬檢測試劑盒(美國，恩佐)對自噬體進行了染色。使用熒光顯微鏡(Eclipse Ti-S，Nikon，Japan)對細胞照相，并使用流式細胞儀(FC500 MPL，Beckman Coulter)檢測熒光強度。

1.2.4siRNA轉染 siRNA序列的合成(上海基因制藥有限公司，中國)如下：miR-210 siRNA，5′-UCAGCCGCUGUCACACGCACAG-3′；HIF-1αsiRNA正義，5′-CCACCACUGAUGAAUUAAATT-3′和HIF-1α反義，5′-UUUAAUUCAUCAGUGGUGGTT-3′，BDNF siRNA正義，5′-GAGCGUGUGUGUGACAGUAUUTT-3′和BDNF反義，5′-AAUACUGUCACACAC′。將細胞鋪板24 h，然后使用X-tremeGene siRNA試劑(Roche)將miR-210 siRNA，HIF-1αsiRNA或BDNF siRNA轉染。

1.2.5細胞內GSH/GSSG水平檢測 將細胞在6孔板中鋪板24 h，將細胞用冷PBS洗滌一次。使用GSH和GSSG測定試劑盒(中國Beyotime)進行細胞內GSH/GSSG水平檢測。

2 結 果

2.1乏氧對細胞凋亡，ROS產生和自噬的影響 與正常氧條件下(21%O2)相比，乏氧處理(2%O2)下的細胞凋亡(圖1A)，ROS產生(圖1B)和自噬體形成(圖1C，1D)顯著增加。這些作用是時間依賴性的。

圖1 乏氧對細胞凋亡、ROS生成及自噬的影響

2.2乏氧處理下HIF-1α和miR-210的表達 與正常氧條件下相比，乏氧處理超過12 h后，HIF-1α和miR-210顯著增加(圖2A-C)。在乏氧下，用HIF-1αsiRNA轉染后，miR-210的表達顯著降低(圖2D，E)。這些提示miR-210是HIF-1α的下游靶標。

圖2 乏氧條件下HIF-1α與miR-210的關系

2.3miR-210對ROS產生，細胞凋亡和GSH/GSSG水平的影響 在乏氧條件下，與對照組細胞相比，miR-210干擾后表達水平降低的細胞的細胞凋亡和ROS水平顯著增加(圖3A-C)。此外，在乏氧條件下，miR-210的干擾可顯著降低GSH / GSSG水平(圖3D)。

圖3 乏氧條件下miR-210對ROS生成、GSH/GSSG和細胞凋亡的影響

2.4miR-210，BDNF，NF-κB與自噬之間的關系 miR-210與BDNF的3′UTR內的高度保守序列結合(圖4A)。 在miR-210受到siRNA干擾后，BDNF mRNA和蛋白表達均增加(圖4B，4C)。此外，p-NF-κB p65隨著BDNF的干擾而增加(圖4D)。當BAY11-7082(10μM，24 h)抑制p-NF-κBp65時，LC3-II和LC3-I的比例從3.2降低到1.9(圖4E)。提示miR-210可能通過BDNF /NF-κB途徑影響自噬。

圖4 miR-210、BDNF、NF-κB與自噬的關系

3 討 論

乏氧的發生會導致許多病理狀況產生,它會對細胞和組織的生物學功能產生不利影響，傷口和組織重塑會導致脈管系統的破壞和受損組織內氧氣的供應減少，進而引起乏氧狀態[7]。研究證實乏氧是加重缺血再灌注[8]，中風[9]和放射[10]引起的組織損傷的誘導劑。乏氧會導致ROS水平的升高，包括過氧化物，超氧化物，羥基自由基等，這些都是由NADPH氧化酶和黃嘌呤氧化酶調節的[11]。研究發現乏氧下HIF-1α表達增加，隨后刺激ROS形成, ROS形成的增加促進FoxO3a的活性，然后通過增加Bim和Bax并降低Bcl-xL和Bcl-2來誘導凋亡[12]。已發現MiRNA與多種生物學過程有關，包括細胞增殖，分化，凋亡和血管生成[13]。既往研究表明，包括miR-210在內的幾種miRNA對乏氧都有反應。既往研究已證實miR-210在細胞周期調控和DNA損傷中起作用[14]。 miR-210過表達誘導的ROS的產生與凋亡有關。在癌癥中，已證明miR-210在神經母細胞瘤，肺腺癌，腎細胞癌，食管鱗狀細胞癌和肺腺癌中以促凋亡的方式起作用[15]。

BDNF可以通過調節中樞神經系統來保護心臟，并通過募集內皮細胞來促進缺血組織的新生血管形成[16]。BDNF可以結合原肌球蛋白相關的激酶B(TrkB)。 BDNF-TrkB的結合促進了促分裂原活化蛋白激酶/細胞外信號調節激酶(MAPK/ ERK)，磷脂酶Cγ(PLCγ)和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)通路的激活[17]。進一步的研究表明，BDNF /原肌球蛋白相關激酶B(TrkB)通路通過增加Bcl-2表達并抑制caspase-3活性，進而具有抗缺血凋亡的作用[18]。已知有幾種miRNA會影響BDNF表達的轉錄后控制，包括miR-16，miR-22，miR-195和miR-210[19]。研究已發現miR-210通過靶向BDNF來調節局部麻醉誘導的脊髓神經毒性和背根神經節(DRG)神經毒性。此外，BDNF抑制作用可以逆轉miR-210下調對布比卡因誘發的DRG神經毒性的保護作用[20]。本研究中我們發現miR-210是HIF-1α的下游靶標，并且在乏氧條件下被上調，這與既往研究一致。在成纖維細胞中，miR-210的表達下調可導致BDNF表達升高。

核因子(B(NF-κB)是一種轉錄因子，已有研究發現在調節與先天和適應性免疫反應，炎癥反應，應激，細胞存活，細胞增殖和細胞損傷有關的基因的表達中起著核心作用。 NF-κB是五個亞基的二聚體，如RelA(p65)，RelB，c-Rel，NF-κB1(p50)和NF-κB2(p52)，其中最豐富且普遍存在的是p50-p65異二聚體。通過與IκB抑制蛋白的成員相互作用，它以潛在形式存在于細胞質中。 NF-κB可以通過破壞與IκB的相互作用激活。釋放的NF-κB易位至細胞核，然后與靶基因的啟動子和增強子區域的κB元素結合，導致基因表達受抑制[21]。研究表明，BDNF也可以激活NF-κB。另外，BDNF可以通過抑制海馬神經元中的NF-κB信號傳導來刺激白介素-1β(IL-1β)[22]。這些提示NF-κB是BDNF和自噬之間的一種可能的介質。本研究還發現，BDNF下調會增加p-NF-κBp65的表達，而p-NF-κB受抑制會導致自噬水平降低。這些表明NF-κBp65的表達可能與BDNF和自噬密切相關。

綜上，我們的研究發現乏氧/HIF/miR-210在乏氧條件下的細胞存活中起著重要作用。miR-210影響細胞存活的機制與BDNF/NF-κB/自噬信號通路密切相關。它可能為乏氧相關的組織損傷提供潛在的治療方法。