基于GEO差異分析及網絡藥理學的四逆散治療潰瘍性結腸炎作用機制研究△

杜金鑫，楊士偉，辛學知*

1.山東中醫藥大學 第一臨床醫學院，山東 濟南 250014；2.山東第一醫科大學 第一附屬醫院 肛腸科，山東 濟南 250014

潰瘍性結腸炎(UC)是一種慢性非特異性炎癥性疾病，屬于炎癥性腸病(IBD)的一種，常累及直腸，并持續逆行進入結腸。其病因及發病機制尚無定論，病變主要涉及結直腸黏膜層及黏膜下層，臨床表現以腹痛、腹瀉、里急后重、黏液膿血便為主，部分患者還會伴有皮膚、肝臟、眼睛或關節等的腸外表現[1]。目前，UC的治療措施主要有氨基水楊酸類藥物、糖皮質激素、免疫抑制劑、新型生物制劑、白細胞吸附療法、糞菌移植及中醫藥治療[2]。

中醫古籍中未見UC對應病名的記載，目前多認為其屬于中醫學“腸澼”“久痢”“大瘕泄”的范疇。2017年，中醫專家共識將UC的中醫病名歸為“久痢”，并將其分為大腸濕熱證、熱毒熾盛證、脾虛濕蘊證、寒熱錯雜證、肝郁脾虛證、脾腎陽虛證、陰血虧虛證共7個證型[3]。中醫療法治療UC取得了較為理想的臨床療效，相比于西醫療法，中醫藥的優勢在于能夠長期維持UC緩解期，并能降低復發率[4]。四逆散出自《傷寒論》，由柴胡、白芍、枳實、甘草4味藥組成，具有透邪解郁、疏肝理脾之效，可用于治療泄利下重之證。臨床上有多位醫家應用四逆散及其加減方治療UC，且取得了滿意的療效[5-6]，動物實驗表明，四逆散可能通過調節血清促炎因子[7-8]、抑制炎性通路、調控細胞因子網絡平衡[9]來干預UC，但其具體作用機制仍需進一步探究。

本研究利用GEO(Gene Expression Omnibus)數據庫及網絡藥理學方法篩選四逆散有效成分及靶點，與疾病差異基因相互映射取其交集，構建藥物-化合物-靶點調控網絡并進行通路分析，預測四逆散治療UC的潛在靶點及作用機制，為進一步研究提供理論依據。

1 方法

1.1 GEO差異基因分析

在GEO數據庫(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/)中以“Ulcerative colitis”為關鍵詞進行檢索，選取人類正常樣本及UC患者樣本均大于10的GEO數據芯片，下載其相關GSE、GPL文件，進行數據整理分組后導入R軟件，利用Limma包以|lgFC|>1(FC表示差異倍數)、P<0.05為條件篩選出差異表達基因，利用ggplot2包繪制差異基因火山圖；pheatmap包繪制前20位差異基因的熱圖。

1.2 四逆散中化合物及靶點的收集與篩選

借助中藥系統藥理學分析平臺數據庫(TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php)，分別以“柴胡”“白芍”“枳實”“甘草”為關鍵詞檢索四逆散中的化合物成分，以口服生物利用度(OB)≥30%，類藥性(DL)≥0.18為標準篩選出符合標準的化合物作為有效成分。再次通過TCMSP數據庫平臺，將篩選出的四逆散中的有效成分進行檢索，查找與之相對應的靶點信息，在UniProt(https：//www.uniprot.org/)數據庫中查詢靶點對應的基因名稱進行標準化處理。

1.3 構建藥物-化合物-靶點調控網絡

將篩選得到的藥物靶點基因與疾病差異基因相互映射，得到交集基因，并查找與之相對應的有效成分，整理network、type文件，利用Cytoscape 3.7.2軟件進行可視化處理，構建“藥物-化合物-靶點”調控網絡。

1.4 蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)網絡構建與拓撲分析

利用Cytoscape 3.7.2軟件中的Bisogenet插件構建PPI網絡(數據庫來源：DIP、BIOGRID、HPRD、INTACT、MINT、BIND)。通過CytoNCA插件進行拓撲結構分析，以度中心性(degree centrality，DC)>61、介度中心性(betweenness centrality，BC)>600為標準，獲得PPI核心網絡。

1.5 靶點通路分析

利用Bioconductor平臺將靶點基因名轉化為基因ID，以R軟件安裝相關Bioconductor安裝包，設置P=0.05、Q=0.05進行基因本體(GO)富集分析，保存富集結果并選取生物過程(BP)、細胞組分(CC)、分子功能(MF)各自前20位繪制圖形文件。同樣方法進行京都基因與基因組百科全書(KEGG)分析，選取富集排名前20位的通路，利用Cytoscape 3.7.2軟件進行KEGG關系網絡的構建。

2 結果

2.1 GEO差異基因分析

從GEO數據庫中下載GSE87466腸道黏膜基因表達數據。所采用的平臺為GPL13158[HT_HG-U133_Plus_PM] Affymetrix HT HG-U133+ PM Array Plate，共有21例正常人樣本及87例UC患者樣本。以|lgFC|>1、P<0.05為條件共篩選出差異表達基因910個，其中上調基因575個、下調基因335個。差異基因火山圖及前20位差異基因的熱圖見圖1～2。

注：紅色代表上調基因；綠色代表下調基因；黑色代表無差異基因。圖1 UC患者上調和下調的差異基因火山圖

注：紅色代表上調；綠色代表下調。圖2 UC患者上調和下調的前20位差異基因熱圖

2.2 四逆散中化合物成分及靶點的收集與篩選

借助TCMSP數據庫共檢索到四逆散化合物成分共779種，以OB≥30%、DL≥0.18為標準篩選后得到四逆散關鍵化合物成分共144種，其中柴胡17種、白芍13種、枳實22種、甘草92種，部分化合物見表1。通過TCMSP數據庫查找關鍵化合物對應的靶點，刪除重復靶點后共得到239個有效靶點基因。

表1 四逆散中部分有效成分

2.3 藥物-化合物-靶點調控網絡構建

將藥物靶點基因與疾病差異基因相互映射，共得到32個交集基因，并查找與之對應的有效成分，共得到109個有效成分，其中柴胡7個、白芍3個、枳實16個、甘草79個，另有4個有效成分山柰酚、異鼠李素、槲皮素、柚皮素來源于2味或多味中藥。運用Cytoscape 3.7.2軟件構建“藥物-化合物-靶點”調控網絡，具體見圖3。運用網絡拓撲結構分析得到各節點度值，度值排名前4位的化學成分為槲皮素、山柰酚、木犀草素、川陳皮素，排名前4位的靶點為前列腺素內過氧化物合酶2(PTGS2)、一氧化氮合酶2(NOS2)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARG)、激酶插入區受體(KDR)。

注：橙色菱形代表基因；綠色橢圓形代表有效成分；藍色長方形為中藥。圖3 四逆散治療UC的藥物-化合物-靶點網絡

2.4 PPI網絡構建與拓撲分析

利用Cytoscape 3.7.2軟件的Bisogenet插件構建PPI網絡，共得到1568個節點，33 863條邊；利用CytoNCA插件進行拓撲結構分析，以度值>61為標準篩選后得到366個節點，13 439條邊；以BC>600為標準進一步篩選，最終得到核心網絡，該網絡共包含40個節點、415條邊，其中度值排名前10的節點為核仁磷酸蛋白(NPM1)、熱休克蛋白A8(HSPA8)、酪氨酸3/色氨酸5-單加氧酶激活蛋白(YWHAZ)、泛素C(UBC)、含纈酪肽蛋白(VCP)、人異質性胞核核糖蛋白A1(HNRNPA1)、熱休克蛋白90AA1(HSP90AA1)、熱休克蛋白A5(HSPA5)、熱休克蛋白90AB1(HSP90AB1)、異質核糖蛋白U(HNRNPU)，這很可能是四逆散治療UC發揮藥理作用的關鍵靶點(圖4)。

圖4 四逆散治療UC的PPI核心網絡獲取過程

2.5 靶點通路分析

利用R軟件對32個交集基因進行GO富集分析和KEGG通路分析，共篩選得到661個GO條目(P<0.05)及42條KEGG通路(P<0.05)。選取GO富集前20位條目繪制氣泡圖(圖5)，可見靶點顯著富集于對脂多糖的反應、對細菌源分子的反應、白細胞遷移等生物過程；脂閥、膜微區、膜區等細胞組分；細胞因子活性、受體配體活性、細胞因子受體結合等分子功能。

圖5 四逆散治療UC靶點的GO富集分析

同樣選取KEGG通路分析前20位繪制柱狀圖(圖6)，可見疾病方面靶點顯著富集于流體剪應力與動脈粥樣硬化、類風濕性關節炎、瘧疾等。生物通路主要涉及腫瘤壞死因子(TNF)信號通路、白細胞介素-17(IL-17)信號通路、糖尿病并發癥中糖基化絡末產物及其受體(AGE-RAGE)信號通路、Toll-樣受體信號通路、核轉錄因子-κB(NF-κB)通路等。利用Cytoscape 3.7.2軟件構建“靶點-通路”網絡，如圖7所示，圖形大小與連接點數目相關，連接點越多圖形越大，可見TNF通路(hsa04668)與12個靶標相關聯，是所有通路中與疾病靶標相關數最多的通路，因此TNF通路很可能是四逆散治療UC的關鍵通路。

圖6 四逆散治療UC靶點的KEGG通路分析

注：紅色箭頭代表通路；橙色方形代表靶點。圖7 四逆散治療UC的靶點-通路網絡

3 討論

UC為臨床難治性疾病，其病因及發病機制目前尚無確切定論，多認為是遺傳、環境、免疫等多種因素綜合作用的結果[10]。UC在世界范圍內的發病率呈上升趨勢，目前我國尚缺乏全國性基于人口的流行病學調查，多為以醫院為基礎的小規模研究，數據主要集中在單個省份或地區。綜合已發表的數據，在我國，每10萬人中有1～2人患有UC[11-14]。UC治療的最佳目標是持續、持久的非類固醇緩解期，盡量避免手術以及癌癥的發生，且擁有正常健康的生活[15]。

與西醫學相比，中醫藥在誘導UC緩解、預防復發、提高患者生活質量等方面具有獨到的優勢。四逆散為醫圣張仲景所組之經方。方中柴胡疏肝解郁，升舉陽氣，與枳實相配，使得升中有降，共同調理氣機；白芍養血斂陰，與甘草相合緩急止痛，與柴胡相合疏肝理脾；枳實下氣破結，與白芍相伍調氣和血；甘草甘溫益氣健脾、調和諸藥，全方共奏疏肝理脾、調氣和血、緩急止痛、透邪解郁之功。

本研究共篩選出四逆散有效成分144個，其中作用最顯著的是槲皮素、山柰酚、木犀草素、川陳皮素，這四者均為黃酮類化合物。槲皮素具有抗炎、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、降糖等作用[16]。有研究認為，槲皮素可抑制一氧化氮(NO)、前列腺素E2(PGE2)、環氧化酶(COX-2)的水平，并通過抑制NF-κB及絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路發揮其抗炎作用[17]。現有證據表明，富含槲皮素的食物能夠降低UC發病的風險[18]，如果槲皮素以糖基化形式(如蘆丁)呈現，則通過口服途徑給予槲皮素治療UC是可以實現的[19]。山柰酚已被證明是一種有效的促炎分子抑制劑[20]，有研究表明，山柰酚可抑制IL-32誘導的單核細胞分化為巨噬細胞樣細胞，減少胸腺基質淋巴生成素、IL-1β、TNF-α及IL-8等促炎因子的產生及mRNA的表達[21]。木犀草素具有較強的體內外抗炎活性，已被用于治療炎癥相關疾病，有研究認為其抗炎活性來源于對轉錄因子信號傳導與轉錄激活因子3(STAT3)、NF-κB和激活子蛋白-1(AP-1)的調節[22]。Nishitani等[23]的研究表明，木犀草素能夠顯著抑制CD4+T細胞向結腸黏膜的浸潤，提高結腸組織中γ。干擾素(IFN-γ)的表達。李越等[24]認為，木犀草素能夠激活核轉錄因子E2相關因子2(Nrf2)信號通路，抑制促炎因子TNF-α、IL-6 mRNA的表達，增強結腸抗氧化活性，從而減輕UC小鼠結腸組織病理損傷。川陳皮素生物利用度良好，具有抗炎、抗癌、抗氧化、神經保護等作用[25]，能夠抑制蛋白激酶B(Akt)、NF-κB等通路，降低TNF-α、IL-1β、IL-6、NO、PGE2等促炎因子的表達[26]。研究發現，川陳皮素能夠通過降低炎性介質、促炎因子等的表達，顯著緩解UC大鼠的結腸炎癥、降低腸通透性[27]。

根據PPI網絡，可見NPM1、HSPA8、YWHAZ、UBC、VCP、HNRNPA1、HSP90AA1、HSPA5、HSP90AB1、HNRNPU可能是四逆散治療UC的關鍵作用靶點。NPM1是一種磷酸化蛋白，屬于核磷蛋白/核纖溶酶蛋白家族，有維持基因組穩定、調節生長-抑制途徑、感應核仁應激等功能，并在核糖體生物發生中起重要作用[28-29]。HSPA8、HSP90AA1、HSPA5、HSP90AB1均屬于HSP，是高度保守的應激誘導因子，可管理熱應激激活、促進T細胞粘附和遷移、加強免疫監視等，在炎癥、腸道疾病及免疫中具有重要的相關作用[30]。研究表明，HSP參與多種自身免疫性和慢性炎癥性疾病的發病，如UC、克羅恩病、類風濕性關節炎等[31]。YWHAZ可參與多種生理活動的調節，是結合和穩定信號轉導、細胞增殖和凋亡中的關鍵蛋白的關鍵因子[32]。UBC屬于多泛素基因，泛素化為泛素分子修飾靶點的過程，在損傷修復和炎癥免疫等多種生物學功能的調節中起著重要作用[33]，泛素作為一種與泛素化相關的必需蛋白，在UC的炎癥反應中發揮核心作用[34]。VCP是一種同源六聚體AAA ATP酶，與多種細胞功能如泛素蛋白酶體系統、線粒體膜外膜蛋白降解及自噬相關[35-36]。HNRNPA1是一類與復雜多樣的生物學過程相關的RNA結合蛋白，可調節mRNA的剪接、轉錄、核質穿梭和翻譯以及端粒的維持[37]。Moriggi等[38]利用同位素編碼蛋白標記法(ICPL)對UC患者及健康人腸上皮細胞提取物進行蛋白質組學分析，觀察到UC患者HNRPNA1含量較健康人明顯有所增加。HNRNPU是一種RNA結合蛋白，是最重要的mRNA穩定蛋白之一，在哺乳動物發育中起重要作用，有研究認為，HNRNPU可與NF-κB通路介導的長非編碼RNA FIRRE相互作用來增強炎癥基因的mRNA穩定性，從而特異性地促進腸上皮細胞炎癥基因的表達[39-40]。

根據KEGG通路分析，四逆散治療UC的主要涉及的通路為炎癥反應及免疫相關通路，涉及TNF信號通路、IL-17信號通路、糖尿病并發癥中AGE-RAGE信號通路、Toll-樣受體信號通路、NF-κB通路等。 TNF通路與多種免疫性疾病相關，TNF是一種促炎因子，有研究認為，其為UC的主要病理細胞因子[41]，抗TNF療法已成為炎癥性腸病的主要療法之一，且取得了較為滿意的臨床效果。IL-23/17軸在黏膜免疫學和UC發病機制中起關鍵作用，在腸道中，脂多糖和肽聚糖與抗原提呈細胞上的Toll樣受體結合，促進IL-23的釋放，進而誘導Th-17細胞的擴張，導致IL-17的釋放[42-43]。IL-17具有雙重作用，有可能推動慢性黏膜炎癥發展，但也可能通過對Th1細胞反應的負調控發揮抗炎作用[44]。Toll樣受體是固有免疫中免疫受體的代表，過多的Toll樣受體激活通過持續的促炎細胞因子和趨化因子的產生來破壞免疫動態平衡，從而導致許多炎癥性和自身免疫性疾病的發生[45]，Toll樣受體活性增強很可能會導致腸道的先天免疫反應激活，進而誘發UC的發生[46]。據報道，在參與UC的信號通路中，NF-κB通路占據重要地位，在調節UC患者細胞因子的釋放中起核心作用[47]。NF-κB作為一種逆轉錄因子，能夠調節多種生理過程，包括天然和獲得性免疫反應、細胞凋亡、細胞增殖、炎癥和惡性轉化等，在調節炎性細胞因子的表達中起著至關重要的作用[48-49]，通過調節NF-κB通路治療UC已成為當前關鍵治療策略之一。

綜上所述，本研究以四逆散中有效成分為研究對象，通過聯合GEO差異分析及網絡藥理學初步探究了四逆散治療UC的作用機制，為四逆散治療UC提供了新的參考依據，但本研究仍存在一定局限性，仍需進一步研究進行完善。