CD3+CD56+NKT細胞及其細胞因子在Graves病患者體內的表達

羅婉瑩 曹敏 竇文婷 田睿 林敏 任來春 王浩華 鄒原方

GD 是甲狀腺功能亢進癥(甲亢)的最常見病因,約占全部甲亢的80%～85%,臨床表現主要為：①甲狀腺毒癥；②彌漫性甲狀腺腫；③眼征；④脛前黏液性水腫［1］。GD 具有遺傳易感性特點,其發病機制尚未明確,臨床認為與自身免疫、遺傳、環境因素有關,其中自身免疫為主要因素。在多種因素作用下,GD 可使機體免疫功能下降,導致抗原特異或非特異性抑制性T 細胞(Ts)發生缺陷、功能下降,繼而削弱對輔助性T 細胞(Th)的抑制作用,加上Th 不適當致敏和白細胞介素-1(IL-1)、IL-2 等的共同參與,使特異性B 淋巴細胞產生大量異質性免疫球蛋白(自身抗體)［2］。其中NKT 細胞兼有NK 細胞和T 細胞的特性,具有雙向免疫調節功能［3］。本研究旨在探討GD 患者外周血中NKT 細胞及其細胞因子(IL-2、IL-6、IL-10、TNF-α)的表達,從而探討GD 的發病機制。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2018 年1 月～2019 年12 月在本院確診的19 例GD 患者作為實驗組,另選擇同期19 例健康志愿者作為對照組。實驗組患者均符合第7 版內科學診斷標準［4］,其中男5 例,女14 例；年齡18～59 歲,平均年齡(36.7±8.3)歲。對照組男11 例,女8 例；年齡18～59 歲,平均年齡(37.3±7.9)歲。兩組一般資料比較差異無統計學意義(P＞0.05),具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 外周血NKT 細胞檢測方法 儀器：貝克曼庫爾特FC500MCL 流式細胞儀。試劑：單克隆抗體CD45-FITC、CD3-PC5、CD56-PE、RBC 裂解液(貝克曼公司提供)。步驟：在同一流式專用試管中加入上述單克隆抗體(CD45-FITC、CD3-PC5、CD56-PE)各5 μl,同時加入EDTA 抗凝全血50 μl,混勻,避光孵育20 min；加入RBC 裂解液500 μl 裂解20 min；加入磷酸緩沖鹽溶液(PBS) 500 μl 上機檢測。用CD45/SS 設門圈定淋巴細胞群,在十字門圖中分析CD3+與CD56+雙陽性區域細胞百分比,即為CD3+CD56+NKT 細胞百分比(NKT細胞百分比)。

1.2.2 血清中細胞因子及甲狀腺功能指標檢測方法 儀器：BPC-1000 化學發光儀；試劑：IL-2、IL-6、IL-10、IL-12、TNF-α 等細胞因子檢測試劑盒(BPC 公司提供)。實驗步驟：患者均于清晨6:00 空腹采取靜脈血3 ml(使用外周血促凝管),離心,取上清。使用化學發 光法檢測血清中IL-2、IL-6、IL-10、IL-12、TNF-α 水平；電化學發光法檢測FT3、FT4、TSH、TPOAb 水平。其中IL-2 的正常參考值為0.08～5.71 pg/ml,IL-10 的正常參考值為0.19～4.91 pg/ml,檢測值為非正常范圍內即為陽性。

1.3 觀察指標 檢測并比較兩組甲狀腺功能指標(FT3、FT4、TSH、TPOAb)、IL-6、TNF-α 及NKT 細胞水平,IL-2、IL-10 陽性率,探討FT4、TSH、TPOAb與NKT 細胞及細胞因子的相關性。

1.4 統計學方法 采用SPSS22.0 統計學軟件進行數據統計分析。符合正態分布的計量資料以均數±標準差() 表示,采用t 檢驗；偏態分布的計量資料以中位數(第25 百分位數,第75 百分位數)［M(P25,P75)］ 表示,組間比較采用Mann-Whitney 秩和檢驗；計數資料以率(%)表示,采用χ2檢驗；相關性檢驗采用Pearson 相關分析；以TSH、TPOAb 作為因變量,以IL-2、IL-6、IL-10、TNF-α、NKT 細胞水平作為自變量,進行多重回歸分析。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組甲狀腺功能指標、IL-6、TNF-α、NKT 細胞水平比較 實驗組FT3、FT4、TPOAb、TNF-α 和NKT 細胞水平均高于對照組,TSH 和IL-6 水平均低于對照組,差異有統計學意義(P＜0.05)。見表1。

表1 兩組甲狀腺功能指標、IL-6、TNF-α 及NKT 細胞水平比較［,M(P25,P75)］

表1 兩組甲狀腺功能指標、IL-6、TNF-α 及NKT 細胞水平比較［,M(P25,P75)］

注：與對照組比較,aP＜0.05

2.2 兩組L-2、IL-10 陽性率比較 實驗組IL-2和IL-10 陽性率均高于對照組,差異有統計學意義(P＜0.05)。見表2。

表2 兩組IL-2、IL-10 陽性率比較［n(%)］

2.3 FT4、TSH、TPOAb 與NKT 細胞及細胞因子的相關性分析 IL-2、IL-10、TNF-α、NKT 細胞水平與FT4、TSH 和TPOAb 水平密切相關,IL-6 水平與TSH水平密切相關(P＜0.05)。見表3。

表3 FT4、TSH、TPOAb 與NKT 細胞及細胞因子的相關性分析

2.4 甲狀腺功能、TPOAb 與NKT 細胞及其細胞因子的關系 以TSH 水平為因變量,IL-2、IL-6、IL-10、TNF-α、NKT 細胞水平為自變量,采用進入法納入變量,結果顯示IL-10水平與TSH水平呈負相關(P＜0.05)。見表4。以TPOAb 水平為因變量,IL-2、IL-6、IL-10、TNF-α 和NKT 細胞水平為自變量,采用進入法納入變量,結果顯示IL-10 水平與TPOAb 水平呈負相關(P＜0.05)。見表5。

表4 以TSH 為因變量的多重回歸

表5 以TPOAb 為因變量的多重回歸

3 討論

GD 是甲亢的最常見病因,其中T 細胞介導引起血清TPOAb、抗甲狀腺球蛋白抗體(TGAb)、TSH 受體抗體(TRAb)水平異常,是其重要特點,但GD 患者甲狀腺相關抗體的產生目前研究較少,其機制尚不清楚。

NKT 細胞具有T 細胞和NK 細胞的特性,可同時表達NK 細胞受體NK1.1(CD161)和恒定的T 細胞抗原受體(TCR)αβ 受體,其表型和功能與免疫細胞(B 細胞、T 細胞及NK 細胞等)卻有差異,是特殊類型的淋巴細胞,而且可對由CD1d 分子呈遞的特異性糖脂類分子抗原進行識別,并迅速分泌大量白細胞介素-4(IL-4)、γ干擾素(IFN-γ)、IL-10、白細胞介素-13(IL-13)等細胞因子,參與機體先天性免疫及獲得性免疫,具有雙向免疫調節功能,從而在抗感染、抗腫瘤及抑制自身免疫疾病方面發揮重要作用［5］。研究發現,NKT 細胞參與了GD 的發病過程,在各種微環境下其可釋放不同的細胞因子,從而對Th0 向Th1、Th2 的分化進行調節,完成不同的免疫應答［6］。本研究結果顯示,GD 患者NKT 細胞水平顯著高于健康人,差異有統計學意義(P＜0.05)；且NKT 細胞水平與患者甲狀腺功能密切相關(P＜0.05)。提示NKT 細胞在GD 發病過程中起重要作用,與相關研究結果一致,但NKT 細胞在GD 具體發病過程中起何種作用,國內外缺乏相關文獻報道,作者猜測NKT 細胞通過分泌相關細胞因子,調節細胞免疫及體液免疫,從而影響GD 發病過程。

IL-2、IL-6、IL-10、TNF-α 是NKT 細胞分泌的重要細胞因子,在細胞毒作用和免疫調節中扮演著重要角色。有研究發現,NKT 細胞分泌IL-2、IL-6、IL-10、TNF-α 影響Th0 向Th1/Th2 分化,參與GD 的發生,Th0 細胞向Th1 的極化,具體表現為Th1 活化后分泌IL-2、TNF-α 等細胞因子,Th1 活化后主要介導細胞免疫應答［7-11］,其中林莉等［12］報道,Th1 的活化(細胞免疫介導)與GD 的發病有關,此外Th2 的活化(體液免疫介導)可誘導產生甲狀腺相關抗體和GD 發病,但在GD 發病中細胞免疫與體液免疫如何相互發揮作用,國內外鮮有報道,這也是本次研究的重點。本次研究結果中,IL-2、IL-10、TNF-α、NKT 細胞水平與FT4、TSH 和TPOAb 水平密切相關(P＜0.05)；提示NKT 細胞相關細胞因子在GD 患者甲狀腺功變化中有著特殊意義；且實驗組TNF-α 水平高于對照組,差異有統計學意義(P＜0.05)；提示在GD 發病中 Th1 存在活化,但GD 患者IL-10 水平顯著下降,Th2 存在明顯抑制；此外,多重回歸分析結果表明,當TPOAb 高水平時,IL-10 表達受到抑制,以上結果均支持Th2 活化受到一定抑制。本次研究表明,NKT 細胞及其細胞因子可能介導了GD 患者Th0 細胞向Th1 為主要極化,細胞免疫可能是GD 發病早期的主要免疫應答方向,后續甲狀腺相關抗體升高,可能在Th1 活化基礎上體液免疫應答的結果。有文獻報道,GD Th 的偏移有階段性變化,可能早期向Th1 極化,后期向Th2 極化為主［7］,這與本次研究一致。另外,本研究結果顯示,Th1 的細胞因子IL-2 在GD 患者中表達顯著減少,猜測可能是由患者處于不同疾病階段、細胞因子網絡的復雜性、抗甲狀腺藥物的干擾和實驗方法條件不同所導致。后續需要大量臨床及基礎研究進一步揭示GD 患者Th1/Th2極化因素及相互關系,這有利于進一步明確GD 的發病機制。

綜上所述,GD 發病過程中NKT 細胞水平增高,并可能通過分泌相關細胞因子介導Th0 向Th1 的分化,但由于研究樣本數量局限、患者發病時間未能有效一致及可能存在多種細胞因子相互作用,對結果可能存在一定干擾,需要大樣本臨床研究及相關基礎研究進行明確,對于將來有望開展特異性免疫干預治療,為臨床提供更為有效的診治手段。