韭菜籽黃酮的微波輔助提取及其抗氧化活性研究

李敬，尤穎，呂惠麗

(河北經(jīng)貿大學 生物科學與工程學院，石家莊 050061)

韭菜籽含有硫化物、黃酮、維生素C等多種活性成分[1-2]，具有溫補肝腎等功效[3]，是我國中醫(yī)藥學中的常用藥材之一，于《名醫(yī)別錄》中有所記載，其性溫，味辛，為激性劑，具有較高的藥用價值。作為藥食同源的植物種子，韭菜籽還常被制成調味品，用于增加食品的辛辣程度。韭菜籽資源豐富，但是目前韭菜籽的開發(fā)利用卻十分有限，只有少部分用于醫(yī)學研究和種子保護，造成韭菜籽資源的浪費。

近年來，國內外的相關學者對韭菜籽的組成成分、藥理作用等方面做了進一步深入的研究，雖然對韭菜籽藥理學方面的研究較為深入，但對于其某種具體的活性成分提取工藝的研究較少，如總黃酮類化合物。黃酮類化合物具有多種功效，因此應用廣泛。在醫(yī)藥方面，白莉等[4]在最新的研究中發(fā)現(xiàn)，韭菜籽總黃酮具有緩解痛經(jīng)的作用；在功能性食品應用方面，黃酮類化合物可作為食品添加劑原料，制成天然抗氧化劑、天然著色劑、天然增味劑等食品添加劑。目前從植物中提取黃酮類化合物常用溶劑提取法[5-7]，因乙醇無毒，不會引起人體不適，故工業(yè)上常用乙醇作為提取劑，但提取時間過長。

本試驗以韭菜籽為主要原料，采用微波輔助提取法從韭菜籽中提取總黃酮類化合物，通過正交試驗來確定韭菜籽總黃酮的最佳提取工藝，并研究其抗氧化性，為韭菜籽資源的合理利用及開發(fā)天然抗氧化劑提供了科學依據(jù)。

1 材料與設備

1.1 材料與試劑

韭菜籽：購自S.A.申奧中藥材店鋪；蘆丁標準品、亞硝酸、硝酸鋁、氫氧化鈉、無水乙醇、水楊酸、硫酸亞鐵、過氧化氫：以上試劑均為分析純。

1.2 試驗設備

LK-600A中藥粉碎機 上海新諾儀器設備有限公司；722分光光度計 上海菁華儀器有限公司；BS-2239分析天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；JOYNH1C1微波爐 佛山市順德區(qū)格蘭仕微波爐電器有限公司；9240MBE電熱干燥箱 上海博訊實業(yè)有限公司。

2 試驗方法

2.1 韭菜籽總黃酮的測定方法

2.1.1 韭菜籽預處理

韭菜籽在105 ℃的溫度下恒溫干燥4 h，磨碎后過篩，備用。

2.1.2 配制標準溶液

本試驗用分析純蘆丁標準品作為黃酮化合物，制作標準溶液。

備用液的配制：取兩個100 mL容量瓶，分別編號A，B。精確稱取0.1 g蘆丁標準品，將其溶于體積濃度為80%的乙醇溶液中，將其移入A中定容。將A中溶液作為備用液。精確移取A中溶液10 mL于B，然后用體積濃度為30%的乙醇溶液定容至刻度，混勻。此時即獲得了濃度為0.1 mg/mL的蘆丁標準液。

2.1.3 繪制蘆丁標準曲線

向6支比色管中分別加入0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL的蘆丁標準液，用30%乙醇補充至5 mL。分別向比色管中加入0.4 mL 5%的亞硝酸鈉溶液，混勻。靜置后加0.4 mL 10%硝酸鋁溶液，混勻后加4 mL 4%氫氧化鈉溶液，不足10 mL的用水補齊，靜置15 min。在510 nm處測定吸光度值，制作標準曲線。

2.1.4 提取韭菜籽總黃酮

取磨好的韭菜籽粉5 g于燒杯中，按比例加入配制好的乙醇溶液，使用微波法進行提取[8]。離心、取上清液備用。

2.1.5 計算韭菜籽總黃酮提取率

取上清液1 mL，測定吸光度值，代入標準曲線方程得總黃酮濃度，按下式計算其提取率[9-11]：

2.2 單因素試驗

將指標設定為韭菜籽總黃酮提取率。準確稱取5 g韭菜籽粉，與不同的乙醇體積濃度混合，在不同微波時間、料液比和微波功率情況下進行提取。

2.2.1 乙醇濃度對提取率的影響

設定乙醇濃度分別為40%、50%、60%、70%，在料液比1∶20、微波時間3 min、功率350 W的條件下，從韭菜籽中提取總黃酮。

2.2.2 微波時間對提取率的影響

從經(jīng)濟和工藝操作兩方面考慮，選擇最佳的微波時間。本試驗采用的微波時間分別為2，3，4，5 min，將乙醇濃度設定為60%、微波功率設定為350 W、料液比設定為1∶20進行提取。

2.2.3 料液比對提取率的影響

提取溶液乙醇的添加量會對提取率產生影響，選取合適的料液比可以增加總黃酮的提取量[12-14]，提升其提取效率，同時節(jié)約藥品成本，減少資金投入，更加適于大規(guī)模推廣。設定乙醇濃度60%、微波時間4 min、功率350 W，料液比分別為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40進行提取，考察料液比對提取率的影響。

2.2.4 微波功率對提取率的影響

考察210，280，350，420 W 4個功率對提取率的影響。在60%乙醇、料液比1∶20、微波時間3 min的條件下進行提取。

2.3 正交試驗

根據(jù)單因素試驗結果設計正交試驗，見表1。

表1 正交試驗因素水平表

2.4 測定抗氧化性試驗

2.4.1 清除DPPH·自由基試驗

DPPH·自由基可以穩(wěn)定地存在于有機溶劑中，在乙醇溶液中呈現(xiàn)深紫色。當存在某些物質可以與其所帶的單電子配對時，DPPH·自由基將失去氧化性。因此，根據(jù)DPPH·自由基的這一特性可以測定韭菜籽總黃酮的抗氧化性。DPPH·自由基經(jīng)配對后顏色變淺，吸光度也因此降低，并且其最大吸收波長為517 nm，所以選擇在此波長處采用分光光度法測定韭菜籽總黃酮對DPPH·的清除率[15]。

稱取0.0204 g DPPH·，用無水乙醇溶解，在容量瓶中定容，搖勻。取6支10 mL容量瓶，分別編號1～6。在1～6號瓶中分別加入0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mL本試驗提取的韭菜籽總黃酮，用無水乙醇定容。將1～6號瓶中溶液作為樣液測定其對DPPH·的清除率。取6支10 mL比色管，分別編號1～6，均加入2 mL DPPH·溶液，從1～6號瓶中取2 mL樣液分別加入1～6號比色管中，充分振蕩后，避光靜置30 min，測定其在517 nm處的吸光度，記為A1～A6。計算DPPH·自由基清除率，公式如下：

式中：A0為2 mL DPPH溶液與同體積乙醇的吸光度；Ai為2 mL DPPH溶液與同體積總黃酮的吸光度；Aj為2 mL無水乙醇溶液與同體積總黃酮的吸光度。

2.4.2 清除·OH自由基試驗[16]

分別取不同濃度樣液1 mL，加入1 mL 5 mmol/L水楊酸、1 mL 5 mmol/L FeSO4，混勻后加入1 mL 5 mmol/L H2O2，37 ℃反應0.5 h，在波長510 nm處測定吸光度。利用蒸餾水作為參比(若溶液不足4 mL時用蒸餾水補足至4 mL)?？傸S酮對羥基自由基(·OH)清除率的計算公式如下：

3 結果與討論

3.1 蘆丁溶液標準曲線

由蘆丁標準曲線圖(見圖1)可得標準曲線方程為：y=11.204x+0.0196(y為蘆丁溶液濃度，mg/mL；x為吸光度值)，均方差R2=0.9658。

圖1 蘆丁溶液標準曲線

3.2 各單因素對總黃酮提取率的影響

3.2.1 乙醇體積濃度對提取率的影響

由圖2可知，乙醇濃度為40%～60%時，提取率隨濃度增加而增加，最大值為0.16‰。但乙醇濃度若繼續(xù)增加，提取率下降。原因是乙醇濃度過大時，韭菜籽中其他醇溶性物質溶解量增加，導致總黃酮提取率下降。因此，選取乙醇濃度40%、50%、60% 3個水平進行正交試驗。

圖2 乙醇濃度對韭菜籽總黃酮提取率的影響

3.2.2 微波時間對提取率的影響

由圖3可知， 總黃酮提取率隨著微波時間的增加出現(xiàn)先上升后下降的趨勢。在4 min時提取率最高，若微波時間繼續(xù)增加，提取率開始下降，可能是隨著微波時間的增加，總黃酮類物質發(fā)生了氧化反應，導致提取率下降。因此，選取微波時間3，4，5 min 3個水平進行正交試驗。

圖3 微波時間對韭菜籽總黃酮提取率的影響

3.2.3 料液比對提取率的影響

由圖4可知，隨著料液比的增加，提取率先增大后減小。當料液比為1∶20時，提取率最高，為0.92‰。因此，最佳料液比為1∶20。

圖4 料液比對韭菜籽總黃酮提取率的影響

3.2.4 微波功率對提取率的影響

由圖5可知，總黃酮提取率先隨著微波功率的增加而增加，在350 W時最高，為0.44‰，但功率超過350 W時，提取率下降。這可能是由于微波功率過高，破壞了韭菜籽總黃酮的結構。因此，選取微波功率280，350，420 W 3個水平進行正交試驗。

圖5 微波功率對韭菜籽總黃酮提取率的影響

3.3 正交試驗結果

根據(jù)正交試驗結果(見表2)，韭菜籽黃酮的最佳提取工藝為：料液比1∶20，乙醇濃度60%，微波時間4 min，功率350 W，此時總黃酮提取率為76.36‰。

表2 正交試驗結果

續(xù) 表

運用微波提取技術提取總黃酮的依據(jù)是，韭菜籽粉吸收微波后其中的偶極子會發(fā)生旋轉、離子進行傳導，使得體系中分子的膨脹頻率急劇增加，在這種情況下，總黃酮分子極易從韭菜籽內部擴散到提取液乙醇溶液中，從而將韭菜籽總黃酮提取出來。在最佳提取條件下，本試驗的韭菜籽總黃酮提取率為76.36‰，與郭奎彩等[17]采用超聲提取法從韭菜籽中提取總黃酮的得率為5.71‰相比，本試驗的提取率更高，同時能有效地降低生產成本，操作過程安全可靠，可以在未來進行大規(guī)模推廣，廣泛應用于工業(yè)生產中。

3.4 韭菜籽總黃酮的抗氧化性

3.4.1 DPPH·清除能力

由圖6可知，韭菜籽總黃酮對DPPH·的清除作用明顯，清除率隨著總黃酮濃度的增加而增加，當總黃酮濃度為0.034 mg/mL時，清除率達到82.36%。

圖6 不同濃度韭菜籽黃酮對DPPH·的清除率

3.4.2 ·OH清除能力

由圖7可知，隨著韭菜籽總黃酮濃度的增加，其對·OH自由基的清除能力增強，總黃酮濃度在0.0057～0.0342 mg/mL之間時，·OH自由基的清除率為40.98%～61.20%，說明韭菜籽總黃酮的抗氧化能力較強。

圖7 不同濃度韭菜籽黃酮對·OH的清除率

4 結論

總黃酮不僅能控制有害菌的生長，還能有效防止食品氧化，是目前國內外研究的熱點之一。本試驗采取微波輔助提取法從韭菜籽中提取總黃酮，旨在確定韭菜籽總黃酮的最佳提取工藝，并探索韭菜籽總黃酮的抗氧化性。結果表明，韭菜籽總黃酮的最佳提取工藝為：60%乙醇，微波時間4 min，料液比1∶20 (g/mL)，功率350 W。此外，韭菜籽總黃酮對DPPH·和·OH有一定的清除作用，并且在試驗所選擇的范圍內，抗氧化能力隨著韭菜籽總黃酮濃度的增加而加強，表明韭菜籽總黃酮可以作為天然的食品抗氧化劑及防腐劑。如今社會越來越重視天然產品，韭菜籽總黃酮作為一種純天然、無公害的提取物，不僅可以作為天然著色劑、天然增味劑等食品添加劑原料，還可以將其應用于對人體起抗衰老作用的功能性食品中，在功能性食品應用方面有廣闊的發(fā)展空間。