醬香型大曲中產醬香芽孢桿菌的代謝產物分析研究

侯智勇，劉陽

(四川旅游學院，成都 610100)

醬香在我國已有上千年歷史，因其香味獨特、應用廣泛、獨具魅力而受到大眾喜愛，同時其產香機理及風味成分復雜，使得眾多研究者致力于醬香風味成分的研究[1-4]。對于產醬香微生物已有些報道，許多研究結果顯示芽孢桿菌與產醬香風味關聯度比較大[5-6]，這些微生物的代謝活動與發酵過程中物理化學反應的相互重迭作用，最終形成了醬香型白酒中一系列特殊的風味物質[7]。高溫大曲中的微生物對醬香風味的形成尤為重要。羅建超等[8]曾從茅臺酒的大曲中分離出產醬香芽孢桿菌并初步探析其代謝產香；黃永光等[9]也從醬香型白酒生產制曲、堆積酒醅和發酵期酒醅中分離出地衣芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌，并詳述了三類產香芽孢桿菌發酵代謝產香的特征性成分、特征性酶、產香過程風味的特征性變化和群體微生物發酵機制。可見，對高溫大曲中微生物的研究，特別是芽孢桿菌的深入研究分析，有利于揭示醬香的形成機制。

本研究從醬香型白酒大曲中分離得到產醬香風味的菌株，分析其發酵過程中的代謝產物，跟蹤檢測代謝過程中總酸、氨基酸態氮、還原糖的變化過程，并應用固相微萃取及氣質聯用技術檢測其發酵后的揮發性物質，進而對產醬香芽孢桿菌的代謝產物進行研究，為找出醬香的主體香分提供了參考。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種來源

實驗菌株：產醬香芽孢桿菌(從四川某酒廠產醬香高溫大曲中篩得)。

1.1.2 主要儀器

SYQ-DSX-280B型高壓滅菌鍋 上海申安醫療器械廠；QYC-2102C型搖床 上海福瑪實驗設備有限公司；LRH-250型生化培養箱 上海齊欣科學儀器有限公司；6890N-5979B型氣相色譜儀 美國安捷倫公司。

1.1.3 培養基

牛肉膏蛋白胨培養基：蛋白胨10.0 g/L、牛肉膏3.0 g/L、NaCl 5.0 g/L、瓊脂22 g/L，pH 7.0～7.2，121 ℃，0.1 MPa，滅菌30 min。

發酵培養基：小麥150 g，一半打碎，另一半完整混勻后于150 mL蒸餾水中煮25 min，以100 g重量分裝于錐形瓶中，121 ℃滅菌30 min。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種活化

采用無菌操作將3株純種菌株分別接種在斜面培養基上，37 ℃培養24 h，備用。

1.2.2 產醬香菌株固體發酵

用無菌生理鹽水制成菌懸液，以2%接種量加入至發酵培養基中，共計3組平行實驗。每隔24 h觀察發酵情況，待發酵144 h完成后，對每個菌株產醬香情況做感官鑒定，根據產香能力分為：無、+、++、+++、 ++++ 5個等級，檢查培養基的產香情況、褐變情況以及培養基粘性，并做好記錄。

1.2.3 總酸含量的測定[10]

1.2.3.1 測定方法

分別取發酵時間24，48，72，96，120，144 h的樣品10.0 g于研缽中，加入10.0 mL蒸餾水研磨均勻，定容后過濾，用氫氧化鈉標準液滴定，記下消耗氫氧化鈉標準液的體積，計算總酸含量。

1.2.3.2 結果計算

總酸度/(mol/mL)=(c×V×K)/V0。

式中：c為氫氧化鈉標準溶液的濃度，mol/mL；V為滴定所消耗的標準堿液的體積，mL；V0為滴定時吸取的樣液體積，mL；K為換算系數。

1.2.4 氨基酸態氮的測定1.2.4.1 測定方法

采用甲醛法檢測樣品中的氨基酸態氮，根據消耗氫氧化鈉標準液的量，計算出氨基酸態氮含量。

1.2.4.2 結果計算

氨基酸態氮/%=[(V1-V2)×c×0.014×100]/(m×10/100)。

式中：V1為稀釋液在加入甲醛后滴定至pH 9.20所用氫氧化鈉標準溶液的體積；V2為空白滴定在加入甲醛后滴定至pH 9.20所用氫氧化鈉標準溶液的體積；c為氫氧化鈉標準溶液的濃度；m為樣品的質量；0.014為氮的毫摩爾質量。

1.2.5 還原糖的測定[11]

1.2.5.1 樣品處理

分別取發酵時間24，48，72，96，120，144 h的樣品10.0 g，加入100 mL蒸餾水，攪拌20 min，靜置10 min，取上清液即為樣品液。

1.2.5.2 試樣測定

采用斐林試劑鑒定還原糖的方法，直接滴定樣品中的還原糖，直至藍色剛好褪去為終點，記錄樣液消耗體積，同法平行操作3份，得出平均消耗體積。

1.2.5.3 結果計算

η/%=250M2/(V0×V×1000)。

式中：η為樣品中還原糖的含量(以葡萄糖計)；M2為10 mL堿性酒石酸銅溶液(甲、乙液各5 mL)相當于還原糖(以葡萄糖計)的質量；V0為樣品體積；V為測定時平均消耗樣品溶液體積；250為樣品溶液總體積。

1.2.6 GC-MS檢測發酵產物[12]

1.2.6.1 樣品預處理

分別取未接種菌株的空白發酵培養基、3種菌株各自發酵完成后的樣品5 g于頂空瓶中平衡10 min后吸附20 min，將萃取頭移入氣相色譜的高溫汽化室中解吸5 min，進行GC-MS分析。

1.2.6.2 GC-MS條件

色譜、質譜條件以及定性與定量分析方法參照《柑橘果皮中生香酵母的篩選及揮發性香氣成分分析》中的檢測條件和方法。

2 結果與分析

2.1 發酵后感官分析

發酵后觀察小麥固體發酵培養基褐變、粘稠情況以及生香情況，前48 h有豬肉香味，略帶氨味，到72 h有微弱的醬香味，氨氣味消失，到96 h醬香味更突出，到120 h醬香味非常突出，144 h后醬香味濃郁，見表1。

表1 各菌株發酵144 h后培養基特征與產醬香情況

2.2 總酸含量測定

本次實驗采用食品中總酸測定的普遍方法，即電位滴定法作為樣品總酸測定的方法，計算總酸的含量，結果見圖1。

圖1 發酵過程中總酸的變化

由圖1可知，隨著發酵時間的增加，總酸含量也在不斷增加，且都在發酵72 h后總酸突然增大，發酵后期總酸增速小，基本平穩略呈下降趨勢。分析此變化過程，芽孢桿菌在發酵過程中產生大量有機酸，致使發酵產物中總酸含量增加，尤其在發酵第3天，發酵溫度升高后明顯增加，發酵后期一些堿性物質的生成導致總酸增速放慢，酸度有所下降。有研究表明，產醬香芽孢桿菌通常在高溫下能更好地產香，其與美拉德反應有關，而產醬香芽孢桿菌的酸度突然增加也在發酵溫度升高時，與生香情況一致。因此，酸度的變化與醬香的生香情況可能有密切關聯。

2.3 氨基酸態氮的測定

氨基酸態氮含量的測定采用甲醛法，通過計算可得到樣品中氨基酸態氮的含量，結果見圖2。

圖2 發酵過程中氨基酸態氮的變化

由圖2可知，隨著發酵時間的增加，氨基酸態氮含量不斷增加，芽孢桿菌發酵產蛋白酶，蛋白酶能將蛋白質水解為氨基酸，隨著發酵時間的推移，氨基酸態氮含量持續上升。在發酵過程中，蛋白質分解速度與酶的活力、蛋白質含量有密切關系，至發酵結束時氨基酸態氮含量達到最大。氨基酸態氮含量變化體現了游離氨基酸含量的逐漸增加，而游離氨基酸的含量與醬香食品的風味密切相關。

2.4 還原糖的測定

用直接滴定法測定食品中還原糖的含量，結果見圖3。

圖3 發酵過程中還原糖的變化

由圖3可知，隨著發酵時間的增加，還原糖的含量在不斷減少，期間，芽孢桿菌將還原糖分解利用供其生長繁殖，最終發酵樣品中的還原糖經過呼吸作用被全部分解利用，而經過微生物的糖代謝途徑，更易產生多種中間代謝產物及最終代謝產物，進而為醬香風味提供了支撐。

2.5 GC-MS檢測發酵產物

分別檢測未接種菌株的空白發酵培養基、3種菌株各自發酵144 h后的揮發性物質，得到各樣品的總離子流圖譜，見圖4～圖7。對總離子流圖中各數據進行分析，得到各樣品中揮發性香氣成分及相對含量，見表2。

圖4 空白組香氣成分圖譜

圖5 Q1香氣成分圖譜

圖6 Q2香氣成分圖譜

圖7 Q5香氣成分圖譜

表2 4種樣品揮發性香氣成分

由表2可知，3株菌株產揮發性物質有相同的，也有各自獨特的。Q1產揮發性物質最多，達到12種，Q2為9種，Q5為10種。Q1吡嗪相對含量為43.18%，Q2吡嗪相對含量為50.46%，Q5吡嗪相對含量為45.96%，且Q1、Q2 產生的2,3,5,6-四甲基吡嗪相對含量較高，而Q5產生的2,5-二甲基吡嗪相對含量較高。吡嗪含量高低以及所含種類差異是導致所產醬香味不同的原因。

3 結論與討論

醬香型白酒的主體香氣成分一直是白酒行業的研究熱點，到目前為止，關于醬香型白酒的特征香氣成分在學術界仍沒有定論。醬香主體香成分的不確定使得研究思路從源頭上被限制了。因此，從產醬香細菌的角度來看，分析醬香型白酒的主要呈香物質及其形成機制值得進一步深入研究。

本文以小麥為發酵培養基，跟蹤檢測3株產醬香菌株在發酵過程中總酸、氨基酸態氮、還原糖的變化，得到其總酸含量是一個先增后降的變化過程，氨基酸態氮是一個連續增加的過程，而還原糖則是一個連續降低的過程。用固相微萃取及氣質聯用法檢測3株菌株發酵后的揮發性物質，結果顯示：其均有高含量、種類不同的吡嗪，以此可為確定產醬香主體成分提供參考。