熱處理對(duì)葵花分離蛋白結(jié)構(gòu)特性的影響

孫天穎，程紅，陳珂玥，任健*

(1.齊齊哈爾大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.黑龍江省玉米主食工業(yè)化工程技術(shù)研究中心，黑龍江 齊齊哈爾 161006；3.黑龍江省玉米深加工理論與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

葵花蛋白具有較好的吸水吸油性、鹽溶性、起泡性和乳化性等性質(zhì)，將其作為添加劑加到香腸類制品中可有效防止脂肪成分的析出，并且在熏制和蒸煮過(guò)程中減輕收縮現(xiàn)象。葵花蛋白可使午餐肉的彈性、硬度得到改善。葵花醬作為食品調(diào)味料廣泛使用，葵花蛋白水解物也可以做成食品調(diào)味料的基料。因此，葵花蛋白是食品工業(yè)理想的添加劑[1]。

熱處理是食品加工過(guò)程中常用的一種加工手段，熱處理也是影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的主要因素之一，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)隨著熱處理?xiàng)l件的改變而發(fā)生變化，勢(shì)必導(dǎo)致蛋白質(zhì)相應(yīng)的功能特性也隨之發(fā)生變化[2]。本課題組之前探討了熱處理對(duì)葵花分離蛋白和葵花11S球蛋白的持水持油性、溶解性等功能性質(zhì)的影響[3]，本研究將進(jìn)一步討論熱處理對(duì)葵花分離蛋白的氨基酸組成、二級(jí)結(jié)構(gòu)、粒徑分布、表面形態(tài)等結(jié)構(gòu)性質(zhì)的影響，探索葵花分離蛋白結(jié)構(gòu)與其功能性的關(guān)系，為葵花蛋白在食品工業(yè)中的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葵花籽分離蛋白：實(shí)驗(yàn)室制備；胰蛋白酶：諾維信公司；其他試劑均為分析純。

1.2 主要設(shè)備儀器

L-8900型全自動(dòng)氨基酸分析儀 日本日立公司；Q-20型差式掃描量熱儀(DSC) 美國(guó)TA公司； J-815型圓二色譜(CD)儀 日本JASCO公司；TU-1901型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；BT-9300H型激光粒度分布儀 丹東百特儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 葵花分離蛋白的制備

將葵花籽粉碎后用石油醚提取4次，每次3 h，常溫干燥，粉碎后過(guò)60目篩，再采用鹽溶酸沉制得葵花分離蛋白[4]。

1.3.2 葵花分離蛋白的熱處理

葵花分離蛋白的熱變性溫度為102 ℃左右，分別選擇92，102，112 ℃對(duì)葵花分離蛋白進(jìn)行熱處理。將20 mL濃度為8%(V/V)、pH 7.0的蛋白質(zhì)溶液置于50 mL錐形瓶中，在水浴92 ℃、油浴102 ℃和112 ℃條件下進(jìn)行熱處理，時(shí)間為20 min，冰浴冷卻后冷凍干燥。

1.3.3 熱處理葵花分離蛋白結(jié)構(gòu)特性分析

1.3.3.1 氨基酸組成分析

稱取50～60 mg蛋白質(zhì)樣品置于安瓿管中，加入9 mL 6.67 mol/L的鹽酸，充氮后，酒精噴燈封管，在烘箱中酸水解24 h(110 ℃)，加入6 mol/L的氫氧化鈉調(diào)pH 值至2.2，將其導(dǎo)入100 mL容量瓶中，用檸檬酸鈉緩沖液定容，溶液過(guò)膜后裝入樣品瓶中，使用氨基酸分析儀進(jìn)行分析。

1.3.3.2 圓二色譜(CD)

將濃度為0.15 g/L (pH 8.0)的樣品放置于1 mm的比色皿中，采用J-815型圓二色譜(CD)儀開(kāi)始測(cè)試。測(cè)試波長(zhǎng)為190～240 nm；掃描速度為100 nm/min；帶寬為10 nm；數(shù)據(jù)間距為0.2 nm；反應(yīng)時(shí)間為0.125 s；用平均殘基橢圓率表達(dá)CD數(shù)據(jù)。

1.3.3.3 分子柔性的測(cè)定

分子柔性的詳細(xì)測(cè)試方法及計(jì)算公式見(jiàn)文獻(xiàn)[4]。

1.3.3.4 粒徑分布

首先將BT-9300H型激光粒度分布儀預(yù)熱30 min，打開(kāi)Ver 6.0粒徑分析系統(tǒng)，啟動(dòng)超聲波和攪拌器清洗粒度儀，待遮光率為0.00%時(shí)結(jié)束清洗。將不同熱處理?xiàng)l件下的葵花分離蛋白加入樣品槽中，當(dāng)軟件中正常顯示濃度、遮光率在5%以上并且波動(dòng)范圍極小后，開(kāi)始用軟件采集數(shù)據(jù)。

1.3.3.5 掃描電鏡

分別取微量不同熱處理?xiàng)l件下的蛋白樣品進(jìn)行電鏡掃描，詳見(jiàn)文獻(xiàn)[4]。

2 結(jié)果與討論

2.1 蛋白樣品的氨基酸組成分析

不同熱處理?xiàng)l件下蛋白樣品的必需氨基酸分析結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同熱處理?xiàng)l件下蛋白樣品必需氨基酸相對(duì)含量

由表1可知，葵花分離蛋白在不同的熱處理?xiàng)l件下必需氨基酸相對(duì)含量都有所降低，但變化不顯著。因?yàn)闊崽幚砗蟮鞍踪|(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)氨基酸序列沒(méi)有顯著性改變，熱處理改性主要是導(dǎo)致蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)二、三和四級(jí)結(jié)構(gòu)改變，所以反映食品蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的必需氨基酸總量并沒(méi)有減少，但它們的吸收性可能會(huì)因?yàn)榈鞍踪|(zhì)溶解度的降低而受到一定的影響[5]。

2.2 葵花分離蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

不同熱處理?xiàng)l件下葵花分離蛋白的圓二色譜圖見(jiàn)圖1，熱處理后蛋白質(zhì)溶液中各種結(jié)構(gòu)所占的比例見(jiàn)表2。

圖1 不同熱處理?xiàng)l件下葵花分離蛋白的圓二色譜圖

表2 不同熱處理?xiàng)l件下葵花分離蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)

圓二色譜是研究稀溶液中蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的一種簡(jiǎn)單、快速且較準(zhǔn)確的方法，由表2可知，熱處理對(duì)葵花分離蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)具有一定的影響。未經(jīng)處理的葵花分離蛋白在遠(yuǎn)紫外區(qū)195 nm附近有一個(gè)正峰譜帶，在遠(yuǎn)紫外區(qū)210 nm附近有一個(gè)負(fù)峰譜帶，表明葵花分離蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)表現(xiàn)呈松散性，主要是β-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲。經(jīng)92 ℃和102 ℃熱處理后，反映蛋白質(zhì)分子有序性的二級(jí)結(jié)構(gòu)α-螺旋含量顯著增加，β-折疊結(jié)構(gòu)的含量顯著降低后又小幅回升，無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)持續(xù)降低，β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)總體小幅升高，表明適當(dāng)?shù)臒崽幚砜墒沟鞍踪|(zhì)由松散的無(wú)序二級(jí)結(jié)構(gòu)向有序的二級(jí)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，這可能是因?yàn)榘被釟埢g相互作用形成α-螺旋結(jié)構(gòu)所致。112 ℃熱處理后只有松散的β-折疊二級(jí)結(jié)構(gòu)含量顯著增加，其他二級(jí)結(jié)構(gòu)含量都有一定程度的降低，說(shuō)明劇烈熱處理后葵花分離蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)又趨于無(wú)序。

2.3 葵花蛋白分子柔性分析

不同熱處理溫度條件下葵花蛋白分子柔性的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 不同熱處理溫度條件下葵花分離蛋白的分子柔性

蛋白質(zhì)的分子柔性與蛋白質(zhì)的乳化性和起泡性密切相關(guān)，反映了蛋白質(zhì)的伸展情況，是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化的重要參數(shù)之一。由圖2可知，隨著熱處理溫度的升高，葵花蛋白的分子柔性先升高后逐漸降低，92 ℃時(shí)分子柔性達(dá)到最高，繼續(xù)升高熱處理溫度，蛋白質(zhì)分子發(fā)生嚴(yán)重的聚集，分子的剛性增強(qiáng)，分子的柔性下降，且低于葵花分離蛋白[6]，這說(shuō)明適當(dāng)熱處理可顯著提高葵花分離蛋白的分子柔性，主要原因是適當(dāng)溫度條件下的熱處理使得蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)伸展、松散，分子柔性增強(qiáng)。

2.4 葵花分離蛋白的粒徑分布分析

通過(guò)粒徑分析可以客觀地反映熱處理后蛋白質(zhì)的聚集情況，不同熱處理?xiàng)l件下葵花分離蛋白的粒徑分布見(jiàn)圖3。

圖3 不同熱處理?xiàng)l件下葵花分離蛋白的粒徑分布

由圖3可知，熱處理對(duì)葵花分離蛋白的粒徑分布有顯著的影響。未被處理過(guò)的葵花分離蛋白粒徑最小，葵花蛋白的粒徑隨著熱處理溫度的上升而增大。蛋白質(zhì)分子通過(guò)熱處理能夠發(fā)生交聯(lián)或聚集等反應(yīng)，產(chǎn)生蛋白質(zhì)聚集物，從而使蛋白質(zhì)的表觀粒徑增大。

2.5 葵花分離蛋白的電鏡分析

用掃描電鏡(EM)可以更直觀地觀察葵花分離蛋白熱處理后表面形態(tài)的變化，不同熱處理?xiàng)l件下葵花分離蛋白的掃描電鏡結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 不同熱處理?xiàng)l件下葵花分離蛋白的電鏡結(jié)果

由圖4掃描電鏡結(jié)果可以看出，熱處理對(duì)葵花蛋白的表觀形態(tài)具有一定程度的影響。未經(jīng)處理的葵花分離蛋白表面結(jié)構(gòu)緊密，較為光滑。熱處理后的葵花分離蛋白表面形態(tài)發(fā)生了變化，表面結(jié)構(gòu)變得松散且粗糙。隨著熱處理溫度的逐漸升高，其表面的孔隙也增大、增多，導(dǎo)致葵花分離蛋白發(fā)生聚集，在這一過(guò)程中，較多的蛋白質(zhì)分子親水和親油基團(tuán)暴露，有利于蛋白質(zhì)某些功能性質(zhì)的形成。

3 結(jié)論

熱處理對(duì)葵花分離蛋白的結(jié)構(gòu)特性有一定的影響。葵花分離蛋白經(jīng)92，102，112 ℃熱處理20 min后，蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)、分子柔性、粒徑分布、表面形態(tài)等特性發(fā)生了變化。熱處理可使蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)變得無(wú)序；蛋白質(zhì)分子之間發(fā)生交聯(lián)或聚集，表面形態(tài)變得粗糙，結(jié)構(gòu)變得松散，孔隙增多，粒徑增大；適當(dāng)熱處理可使葵花分離蛋白的分子柔性增強(qiáng)。