甘蔗果醋澄清工藝優化及理化性質分析

黃鈺，王凱，伍雅勵，趙文梅，陳禹锜，李楠

(廣西大學 生命科學與技術學院，南寧 530004)

甘蔗(sugarcane)為多年生高大實心草木，主要生長于熱帶和亞熱帶地區[1]。中國的甘蔗產量位居世界第三，廣西是全國最大的甘蔗產地，但是目前廣西地區的甘蔗基本應用于制糖業，為更好地發揮其地理優勢，如何擴大甘蔗加工這一問題急需解決[2]。近年來，隨著大眾對健康生活的不斷追求，果醋因具有保健功效和能保留水果中原有的營養成分等優點，深受人們喜愛[3]。果醋不僅含有人體所需的各種氨基酸、維生素和有機酸類物質[4]，還具有抗氧化、降血糖和降膽固醇等作用[5]。因此，將甘蔗加工成甘蔗果醋是一種有效的解決方法。甘蔗有充足的糖分和水分以及豐富的維生素和礦物質，對人體新陳代謝有極大益處[6]。甘蔗果醋含有多酚和黃酮等物質，多酚具有較強的抗氧化功能[7]，黃酮可以清除人體中的游離自由基，起到延緩衰老的作用[8]。但甘蔗果醋含有大量蛋白質、纖維素和果膠等物質，在生產和儲存時上述物質會發生聚合作用產生沉淀物，導致甘蔗果醋渾濁[9]，嚴重影響人們的感官體驗。酸性蛋白酶是一種蛋白酶，能在較低pH下水解蛋白質[10]，也能夠將甘蔗果醋中的蛋白質水解為氨基酸和多肽，進而使其沉淀。為解決甘蔗果醋中的非生物性渾濁沉淀的問題，本試驗利用酸性蛋白酶來處理甘蔗果醋，并利用響應面法優化酸性蛋白酶對甘蔗果醋的澄清效果，以達到最佳澄清效果。通過甘蔗果醋感官評價表，對在最佳澄清條件下澄清前后的甘蔗果醋進行評價打分，并測定在最佳澄清條件下澄清前后的甘蔗果醋還原糖、總多酚、黃酮、蛋白質及酸度等理化性質，為甘蔗果醋進一步發展利用提供了理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甘蔗：廣西農業科學院提供；甘蔗果酒、甘蔗果醋：本實驗室自釀；釀酒酵母：安琪酵母股份有限公司；醋酸菌：廣西大學生命科學與技術學院朗姆酒研發實驗室自篩；酸性蛋白酶：南寧龐博生物工程有限公司。

1.2 儀器與設備

YP201N電子天平 上海菁華科技儀器有限公司；PL-303分析天平 Mettler Toledo有限公司；UV mini-1240紫外-可見分光光度計 島津儀器(蘇州)有限公司；恒溫水浴鍋、SN510C全自動高壓滅菌鍋 重慶雅馬拓科技有限公司；MQD-S2R搖床 上海旻泉儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 甘蔗果醋釀造工藝

1.3.2 甘蔗果醋澄清單因素試驗

酸性蛋白酶添加量：將添加量為0.2‰、0.4‰、0.6‰、0.8‰、1.0‰、1.2‰的酸性蛋白酶分別加入6份甘蔗果醋中，充分混勻后置于50 ℃的恒溫水浴鍋中，酶解6 h后取出，常溫下靜置2 d后使用紫外分光光度計在725 nm下測其透光率。

酶解時間：將添加量為0.8‰的酸性蛋白酶加入6份甘蔗果醋中，充分混勻后置于50 ℃的恒溫水浴鍋中，分別在酶解2，4，6，8，10，12 h后取出，常溫下靜置2 d后使用紫外分光光度計在725 nm下測其透光率。

酶解溫度：將添加量為0.8‰的酸性蛋白酶加入6份甘蔗果醋中，充分混勻后分別置于35，40，45，50，55，60 ℃的恒溫水浴鍋中，酶解6 h后取出，常溫下靜置2 d后使用紫外分光光度計在725 nm下測其透光率。

1.3.3 響應面法優化甘蔗果醋澄清工藝試驗

根據上述單因素試驗結果，選擇酸性蛋白酶添加量(A)、酶解時間(B)和酶解溫度(C)為影響因素，利用Box-Behnken試驗設計進行優化，以透光率(Y)為響應值進行響應面分析。試驗設計因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗設計因素與水平

1.3.4 甘蔗果醋理化性質研究

還原糖含量的測定：采用DNS法[11]；總多酚含量的測定：采用Folin-Ciocalteu法[12]；蛋白質含量的測定：采用考馬斯亮藍法[13]；酸度的測定：采用中和滴定法[14]。

1.3.5 感官評價

將10份甘蔗果醋樣品隨機分發給10名專業感官評價員，按照色澤、氣味、酸度、澄清度及口感5個評分項目對甘蔗果醋進行評價[15]，評分標準見表2。

表2 甘蔗果醋感官評價標準

1.3.6 數據分析

試驗所得數據均為3次重復試驗測定的平均值，響應面圖采用Design-Expert V8.0.6進行分析，采用Graphpad Prism 8.0作圖，方差分析和顯著性檢驗(P<0.05)采用SPSS 21.0進行分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗對甘蔗果醋的澄清效果

2.1.1 酸性蛋白酶添加量對甘蔗果醋的澄清效果

在酶解時間為6 h，酶解溫度為50 ℃的條件下，考察酸性蛋白酶添加量為0.2‰、0.4‰、0.6‰、0.8‰、1.0‰、1.2‰對甘蔗果醋的澄清效果，結果見圖1。

圖1 不同酸性蛋白酶添加量對甘蔗果醋透光率的影響

由圖1可知，隨著酸性蛋白酶添加量的增加，甘蔗果醋的透光率遞增，當添加量達到1.0‰時，甘蔗果醋的透光率達到最大值81.1%，之后隨著添加量增加，透光率反而下降。因為酸性蛋白酶越多，其分解甘蔗果醋的能力越強，但是酸性蛋白酶過多會導致甘蔗果醋中存在的大分子物質過量，從而有渾濁沉淀形成。綜上所述，選擇1.0‰為最佳添加量。

2.1.2 酸性蛋白酶酶解時間對甘蔗果醋的澄清效果

在酸性蛋白酶添加量為0.8‰，酶解溫度為50 ℃的條件下，考察酶解時間為2，4，6，8，10，12 h對甘蔗果醋的澄清效果，結果見圖2。

圖2 不同酶解時間對甘蔗果醋透光率的影響

2.1.3 酸性蛋白酶酶解溫度對甘蔗果醋的澄清效果

在酸性蛋白酶添加量為0.8‰，酶解時間為6 h的條件下，考察酶解溫度為35，40，45，50，55，60 ℃對甘蔗果醋的澄清效果，結果見圖3。

圖3 不同酶解溫度對甘蔗果醋透光率的影響

由圖3可知，隨著酶解溫度的升高，甘蔗果醋的透光率先增加后減少，當酶解溫度達到55 ℃時，透光率達到最大值，為86.5%。因為隨著酶解溫度的升高，酸性蛋白酶活性也隨之提高，當達到最適酶解溫度的臨界點后，溫度的增加會影響其酶活，從而減弱澄清效果。綜上所述，選擇55 ℃為最佳酶解溫度。

2.2 響應面優化法對甘蔗果醋的澄清作用

2.2.1 Box-Behnken試驗設計方案及試驗結果

根據上述單因素試驗結果，選擇酸性蛋白酶添加量(A)、酶解時間(B)和酶解溫度(C)為影響因素，利用Box-Behnken試驗設計甘蔗果醋澄清優化試驗，以透光率(Y)為響應值進行響應面分析。響應面試驗設計與結果見表3，回歸模型方差分析結果見表4，方差相關系數見表5。

表3 響應面試驗設計與結果

表4 回歸模型方差分析結果

表5 方差相關系數

利用分析軟件Design-Expert對所得結果進行多元回歸方程擬合，得透光率(Y)二次多項回歸模型方程：Y=88.38+1.16A+0.40B+0.36C-0.38AB-0.15AC-0.82BC-0.52A2-0.79B2-2.21C2。

由表4可知，模型的P值=0.0201<0.05，達到顯著水平，失擬項的P值=0.1579>0.05，為不顯著水平，說明模型可靠，擬合性良好。一次項A的P值=0.0106<0.05，說明酸性蛋白酶添加量對甘蔗果醋的澄清效果顯著；一次項B和C的P值均大于0.05，說明酶解時間和酶解溫度對甘蔗果醋的澄清效果不顯著；交互項AB、AC、BC和二次項A2、B2的P值均大于0.05，說明上述因素對甘蔗果醋的澄清效果不顯著，酸性蛋白酶添加量、酶解時間和酶解溫度之間的交互作用較弱；二次項C2=0.0020<0.01，說明其對甘蔗果醋的澄清效果極顯著。由F值可得因素A>B>C，即對甘蔗果醋澄清效果影響順序為：酸性蛋白酶添加量>酶解時間>酶解溫度。

轉變教師傳統教學思維模式，使其真正意識到信息技術對教學的作用和意義，將信息技術實際運用到教學實踐當中，只有當教師的思想改變后才能保證信息化教學的順利開展。在信息化教學方式下，學生作為教學主體，但并不代表教師在教學中的作用減少，反而是對教師的素質做出了更高的要求，要做好學生的引導者、協調者、促進者和激勵者。

由表5可知，擬合度R2=0.8706和校正擬合度RAdj2=0.7042數據相差小，說明所設計的模型與實際試驗擬合度較好，可靠性較高；信噪比=6.294>4，說明模型的可信度高；CV=1.10%<5%。綜上所述，證明該模型準確性好，可以用來分析各因素變化對響應值的影響。

2.2.2 各影響因素交互作用分析

各因素對指標影響的響應面圖見圖4。

圖4 各因素交互作用對甘蔗果醋澄清度影響的響應曲面

等高線為橢圓，曲面斜度越高，坡度越陡，則各因素對甘蔗果醋澄清度作用越顯著。由圖4可知，在模型中AB、BC、AC的交互作用不顯著，說明與表4所得數據一致。

利用響應面法對回歸模型進行分析，選擇透光率的最大響應值，得到的最佳響應結果為酸性蛋白酶添加量為1.2‰，酶解時間為3.98 h，酶解溫度為55.25 ℃，此優化條件下澄清透光率的預測值為89.03%。為檢驗試驗結果的真實準確性，由于實際操作情況不能精準達到上述優化條件，因此調整為酸性蛋白酶添加量為1.2‰，酶解時間為4 h，酶解溫度為55 ℃,在此澄清工藝條件下進行3次驗證試驗，得到甘蔗果醋的澄清透光率為91.9%，澄清結果與試驗預測值相近，說明該模型可靠，可以應用響應面對甘蔗果醋澄清工藝進行優化。

2.3 澄清前后甘蔗果醋理化性質研究結果

由表6可知，經過最佳澄清工藝優化后，甘蔗果醋中還原糖、總多酚、蛋白質及總酸相較澄清前均略有下降。

表6 澄清前后甘蔗果醋理化性質變化

2.4 澄清前后甘蔗果醋感官變化

根據表2對澄清前后甘蔗果醋進行感官評價后的結果為：澄清前的甘蔗果醋呈昏暗深褐色，略有果香和醋味，酸味較刺鼻，不透亮且口感單一，得分為62分；澄清后的果醋呈鮮明琥珀色，有香甜的甘蔗香味，酸味濃厚，十分清透且口感豐富，得分為89分。因此，使用酸性蛋白酶對甘蔗果醋進行澄清具有極佳的感官效果。

3 結論

本試驗通過響應面法得到酸性蛋白酶對甘蔗果醋的最佳澄清條件為：酸性蛋白酶添加量為1.2‰，酶解時間為4 h，酶解溫度為55 ℃，在此條件下甘蔗果醋的透光率可達到91.9%。甘蔗果醋經最佳澄清條件澄清后，其還原糖、總多酚、蛋白質和總酸均略下降，但影響不大；感官品質有很大的提升，感官評分從62分提高到89分，所得的甘蔗果醋品質極佳，為甘蔗果醋應用于調味品方面提供了理論依據。