大孔樹脂純化仙草黃酮及成分測定

上官宇晨，黃麗媛，黃熊，何傳波，魏好程，熊何健*

(1.集美大學 食品與生物工程學院，福建 廈門 361021；2.福建省漳州市漳浦縣海洋與漁業局，福建 漳州 363200)

仙草(MesonaBlume.)又名仙人草，為唇形科(Labiatae)涼粉草屬(MesonaBl.)，主要分布于我國福建、廣東、廣西等省份，作為一種藥食兩用的植物資源[1]，廣泛應用于涼茶、燒仙草和龜苓膏等傳統食品的加工[2]。《中華本草》中記載仙草味甘、性寒，有清暑涼血及利尿之功效。現有研究表明，仙草還具有抗氧化、防中暑、降血壓、治療關節疼痛等的功效，且黃酮類物質是仙草主要的功能成分之一。傳統仙草產品的加工工藝較為單一，為提高仙草多糖的提取率和增加燒仙草的風味，加工過程中常加入較高濃度的堿進行堿煮，長時間高溫堿處理對仙草中的黃酮類化合物會產生極大的破壞[3]，造成仙草黃酮資源的浪費。

黃酮類物質的分子量較小，易被人體消化吸收，具有抗氧化、抗菌、降血糖及降膽固醇等功能[4-7]，在食品與醫藥行業應用廣泛[8-9]。黃酮類化合物可以作甜味劑、增鮮劑用于增加調味品的風味，也可以作為功能性調味品的功效成分[10]，仙草黃酮的分離純化能為開發相關功能性調味品、保健食品提供研究基礎。

大孔樹脂吸附是依靠樹脂和被吸附物質之間的范德華引力、靜電作用或氫鍵的作用達到分離、凈化的目的，具有操作簡便、富集效果明顯、穩定性好、選擇性強、可重復利用等優點[11-12]，廣泛應用于花色苷、多酚、黃酮類物質的分離純化[13-14]。近年來，關于大孔樹脂吸附植物中黃酮的研究較多，但來源于不同植物的黃酮類物質極性及組成有所不同，所選用的大孔樹脂的類型差異較大。極性是反映樹脂解吸能力的重要因素，極性越大，樹脂對黃酮的解吸能力越弱[15]。Sephadex LH-20具有清潔、簡單、高效等優點，廣泛應用于分離天然活性物質，適用于黃酮組分的分離[16]。

目前國內仙草的研究主要集中于仙草多糖及相關產品的研發，仙草黃酮的研究尚處于起步階段。本研究采用大孔樹脂柱層析法純化仙草黃酮，并進一步分離、鑒定出兩個主要組分，為工業化制備仙草黃酮提供了技術依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

仙草：產自福建省龍巖市；蘆丁、甲醇：均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；大孔吸附樹脂(HPD-100)：滄州寶恩化工有限公司；Sephadex LH-20：瑞典GE Healthcare公司；乙腈：美國Sigma公司；甲酸：阿拉丁公司；氘代甲醇：色譜純，國藥集團化學試劑有限公司。

玻璃層析柱(Φ16 mm×200 mm)和(Φ20 mm×600 mm)；HD-21-88自動柱層析儀 上海琪特分析儀器有限公司；JDG-0.2冷凍干燥機 蘭州科近真空凍干技術有限公司；Ultimate 3000高效液相色譜儀 Dionex公司；Avance Ⅱ 400 MHz全數字化核磁共振譜儀 瑞士Bruker公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 仙草黃酮的提取及含量的測定

仙草黃酮提取液的配制：取100 g仙草粉末(過80 目篩)，以1∶15 (g/mL)的料液比加入45%乙醇溶液，25 ℃恒溫水浴提取2 h，提取2次，合并濾液，減壓濃縮回收乙醇，濃縮液過濾、離心(4000 r/min，20 min)，定容至250 mL，置于4 ℃冰箱內保存備用。

含量的測定：參考Yang等[17]的方法并稍作修改，采取NaNO2-Al(NO3)3法，以蘆丁為標準品，繪制標準曲線y=0.0011x+0.0251，R2=0.9998，在0.0～400 μg/mL范圍內具有良好的線性關系，總黃酮含量計算公式見式(1)，將樣品適度稀釋后同上法測定并計算樣品黃酮含量。

式(1)

式中：W為樣品黃酮含量，mg/g；C為樣品液中蘆丁濃度，μg/mL；V為樣品液體積，mL；n為樣品測定時的稀釋倍數；M為樣品的質量，g。

1.2.2 大孔樹脂HPD-100靜態吸附動力學曲線

稱取2.0 g預處理的HPD-100樹脂置于150 mL錐形瓶中，加入50 mL仙草黃酮提取液(20 mg/mL)，置于恒溫振蕩器(30 ℃、150 r/min)中反應1，2，4，6，8，12，24 h，過濾，樹脂用蒸餾水充分清洗，加入45%乙醇50 mL于相同條件下洗脫24 h后過濾，分別測定各樹脂平衡液和解吸液中黃酮的濃度，繪制其靜態吸附動力學曲線，見公式(2)和公式(3)。

式(2)

D=(C2×V2)/[(C0-C1)×V1)]×100%。

式(3)

式中：Q為樹脂吸附量，mg/g；C0為吸附前樣液初始濃度，mg/mL；C1為大孔樹脂吸附后樣液濃度，mg/mL；D為解吸率，%；C2為大孔樹脂解吸后樣液濃度，mg/mL；V1為樣液初始體積，mL；V2為解吸液體積，mL；W為大孔樹脂質量，g。

1.2.3 大孔樹脂HPD-100純化條件優化

1.2.3.1 上樣量的選擇

稱取10 g HPD-100大孔樹脂濕法裝柱。取10 mg/mL仙草黃酮溶液進行上樣，上樣流速3 BV/h(1 BV 10 mL)，上樣量1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15 BV，振蕩吸附后(25 ℃，150 r/min，24 h)，水洗，再用3 BV 60%濃度的乙醇溶液解吸，測定各組洗脫液中黃酮含量。

1.2.3.2 上樣流速的選擇

按上述實驗優化條件上樣，分別以1，2，3，4，5 BV/h的流速通過樹脂，吸附8 h，按式(2)測定最終的吸附量。

1.2.4 優化大孔樹脂(HPD-100)分離純化仙草黃酮工藝中動態吸附、解吸實驗

1.2.4.1 洗脫液濃度的選擇

按上述實驗優化條件上樣，待上柱吸附完全后，用蒸餾水洗至流出液無檢出黃酮，分別用30%、40%、50%、60%、70%乙醇以6 BV/h的流速洗脫，每5 min收集一管，測定每管流出液中黃酮的濃度。

1.2.4.2 洗脫流速的選擇

按上述實驗優化條件上樣，待上柱吸附完全后，用蒸餾水洗至流出液無檢出黃酮，再分別用1，3，6 BV/h的60%乙醇洗脫，每5 min收集一管，測定每管流出液中黃酮的濃度。

1.2.5 Sephadex LH-20分離仙草黃酮組分

按上述優化條件柱層析純化仙草黃酮提取液，洗脫液真空濃縮、凍干后得到仙草黃酮樣品(crudeMesonaBlume. flavonoids，CMBF)。用甲醇配制10 mg/mL CMBF樣品液，過濾處理后，于Sephadex LH-20層析柱(Φ16 mm×60 mm)分離，用30%、50%、70%、90%甲醇各100 mL進行梯度洗脫，洗脫速度為0.5 mL/min，每7 min收集一管，用HPLC檢測并收集合并相同吸收峰的樣品，然后進行真空減壓濃縮，冷凍干燥后，冷藏備用，進行下一步的分析鑒定。

1.2.6 高效液相色譜分析

采用高效液相色譜分析純化后的仙草黃酮組分，分析條件：流動相A為乙腈，B為0.1%甲酸，C18色譜柱(Agilent ZORBAX SB-C18，4.6 mm×250 mm，5 μm)，進樣體積：10 μL，檢測波長：280 nm，柱溫：30 ℃，梯度洗脫：0～10 min，90%～80% B，10～35 min，80%～70% B，35～55 min，70%～90% B，流速1 mL/min。

1.2.7 核磁共振譜分析

依據參考文獻[18],取5 mg的仙草黃酮純化組分MBF1、MBF2溶解于0.5 mL DMSO-d6中并轉移至專用的核磁管內，以四甲基硅烷為內標物，在Bruker核磁共振儀上測定氫譜1H-NMR、13C-NMR。

1.3 數據處理

本文所有實驗樣本均設3次平行，數據表示為平均值±標準差，統計分析采用Origin 9.0和MestReNova軟件。

2 結果與分析

2.1 仙草黃酮在HPD-100樹脂上的靜態吸附動力學曲線

由圖1可知，在0～8 h內，隨著吸附時間的延長，樹脂的吸附量也隨之增加。吸附8 h后，隨著時間的增長，曲線趨于平緩，樹脂基本達到飽和吸附量。在1～2 h內，HPD-100樹脂吸附速度較快，吸附量快速接近飽和吸附量的90%，解吸實驗結果表明HPD-100的解吸率最高為(86.47±0.27)%，說明HPD-100大孔吸附樹脂對仙草黃酮有良好的吸附效果。

圖1 HPD-100大孔樹脂的靜態吸附曲線

2.2 實驗條件的確定

2.2.1 上樣量的確定

由圖2可知，隨著粗提液上樣量的增加，流出液中黃酮的質量濃度增大。上樣量為3 BV時，流出液中仙草黃酮的濃度為(0.51±0.07) mg/mL，約為上樣液濃度的5%。當上樣量高于3 BV時，流出液中仙草黃酮的濃度快速上升，吸附的黃酮發生大量泄漏，因此選擇上樣量為3 BV時樣品泄漏的損失最小。

圖2 上樣量對HPD-100大孔樹脂吸附仙草黃酮的影響

2.2.2 上樣流速的確定

由圖3可知，HPD-100樹脂對仙草黃酮的吸附量隨著上樣流速的增加而減少，可能是由于大孔樹脂的吸附速度有限，在同樣的吸附速率下流速加快、相對吸附時間減少，同時流速過大，導致有效成分與樹脂接觸時間不充分，不能被樹脂吸附完全。但流速過慢，影響了生產效率，延長了生產周期，增加了生產成本。與上樣流速1 BV/h相比，在3 BV/h的流速條件下，HPD-100樹脂對仙草黃酮的吸附量僅下降了(4.23±0.08)%。而單位時間內粗提物的上樣量提高了2倍。綜合考慮，選擇3 BV/h為最佳上樣流速。

圖3 上樣流速對HPD-100大孔樹脂吸附仙草黃酮的影響

2.2.3 洗脫濃度的確定

由圖4可知，用30%乙醇洗脫時，流出液黃酮的濃度最低，且洗脫峰不集中，有拖尾峰。用60%乙醇濃度洗脫樹脂時，流出液黃酮的濃度最大。當乙醇濃度上升或者下降時，洗脫量降低，這可能是在60%乙醇的極性條件下易破壞仙草黃酮與HPD-100大孔樹脂的作用位點，使得仙草黃酮容易被置換，提高了解吸的效率。綜合考慮，選擇最佳洗脫劑為60%乙醇。

圖4 洗脫劑濃度對HPD-100大孔樹脂解吸仙草黃酮的影響

2.2.4 洗脫速率的確定

由圖5可知，當洗脫流速為3 BV/h時，仙草黃酮解吸濃度最高，但洗脫峰形不均一，洗脫時間長，效率較低。當洗脫流速達到9 BV/h時，仙草黃酮解吸濃度最低，有較明顯的拖尾峰，這可能是因為流速過快，吸附的黃酮類物質未被完全洗脫下來。當洗脫流速為6 BV/h時，黃酮解吸濃度較高且洗脫峰較為對稱。綜合考慮，最佳洗脫流速為6 BV/h。

圖5 洗脫速率對HPD-100大孔樹脂解吸仙草黃酮的影響

2.3 仙草黃酮的分離與結構鑒定

仙草黃酮提取液經大孔樹脂純化、真空濃縮、凍干后得到仙草黃酮樣品(crudeMesonaBlume. flavonoids，CMBF)，利用Sephadex LH-20柱層析對CMBF進一步分離得2 個化合物MBF1、MBF2。HPLC分析結果見圖6，CMBF峰形較雜，兩種組分MBF1、MBF2均由單一峰組成，且2個樣品純度都達到90%以上，確定2種物質為單一化合物，進行核磁共振譜分析。

圖6 仙草黃酮液相色譜圖

MBF1，褐色粉末，分子量為360.0845，分子式為C18H16O8，1H-NMR(CD3OD, 400 MHz): δH7.49 (1H, d, J=15.9 Hz, H-7), 7.02(1H, d, J=1.6 Hz, H-2), 6.91(1H, dd, J=8.2, 1.6 Hz, H-6), 6.75 (1H, d, J=8.2 Hz, H-5), 6.75 (1H, br s, H-2′), 6.66 (1H, d, J=8.0 Hz, H-5′), 6.62 (1H, br d, J= 8.0 Hz, H-6′), 6.26 (1H, d, J=15.9 Hz, H-8), 5.09 (1H, br d, J=8.0 Hz, H-8′), 3.09 (1H, br d, J=13.3 Hz, H-7′b), 2.92 (1H, dd, J=13.3, 8.0 Hz, H-7′a)。13C-NMR (CD3OD, 100 MHz): δC169.1 (s,C-9),149.4 (s, C-4),146.7 (s, C-3),146.6 (d, C-7),146.0 (s, C-3’),144.8 (s, C-4’),131.2 (s, C-1’),128.0 (s, C-1),122.9 (d, C-6),121.8 (d, C-6’),117.5 (d, C-2’),116.5 (d, C-5’),116.2 (d, C-5),115.7 (d, C-8),115.1 (d, C-2), 38.8 (t, C-7’)。上述光譜數據與文獻[19]對比基本一致，可確定MBF1為迷迭香酸(見圖7)。

MBF2，淺黃色粉末，分子量為448.1006，分子式為C21H20O11，1H-NMR (CD3OD, 400 MHz): δH8.04 (2H, d, J=8.8 Hz, H-2’, H-6’), 6.88 (2H, d, J=8.8 Hz, H-3’, H-5’), 6.38 (1H, br s, H-8), 6.19 (1H, br s, H-6), 5.22 (1H, d, J=7.2 Hz, H-1′), 3.68 (1H, dd, J=11.9, 2.1 Hz, H-6’′a), 3.52 (1H, dd, J=11.9, 5.5 Hz, H-6’′b), 3.27-3.47(3H, m, H-2’’,H-3’’,H-4’’), 3.19 (1H, ddd, J = 9.7, 5.5, 2.1 Hz, H-5’’)。13C-NMR (CD3OD, 100 MHz): δC179.4 (s, C-4), 166.6 (s, C-7),163.0 (s, C-5),161.6 (s, C-4’),159.0 (s, C-2),158.5 (s, C-9),135.4 (s, C-3),132.3 (d, C-2’, C-6’),122.8 (s, C-1’),116.1 (d, C-3’, C-5’),105.5 (s, C-10),104.1 (d, C-1’’),100.1 (d, C-6),94.9 (d, C-8),78.4 (d, C-5’’), 78.0 (d, C-3’’), 75.7 (d, C-2’’), 71.3 (d, C-4’’), 62.6 (t, C-6’’)。上述光譜數據與文獻[20]對比基本一致，可確定MBF2為紫云英苷(見圖7)。

圖7 MBF1、MBF2的結構

3 結論

黃酮類化合物在食品保鮮、抑菌方面應用廣泛，為了更好地利用仙草中的黃酮類化合物，本研究通過考察HPD-100大孔樹脂對仙草黃酮的吸附和解吸能力，發現短時間內HPD-100樹脂吸附量能快速達到飽和吸附量的90%，解吸率最高為(86.47±0.27)%，可以認為HPD-100大孔樹脂是分離仙草黃酮的一種理想樹脂。其最佳純化工藝參數為：上樣量為3 BV，上樣流速為3 BV/h，洗脫劑乙醇濃度為60%，洗脫流速為6 BV/h。經Sephadex LH-20進一步分離純化得到兩個單體化合物，通過1H-NMR、13C-NMR進行鑒定，確定兩種純化物為迷迭香酸與紫云英苷。

本實驗采用大孔樹脂法純化仙草黃酮，操作簡單，效果明顯，仙草原料經乙醇溶液提取黃酮后，仍可加工仙草膠類傳統食品。仙草黃酮的分離制備及進一步的功能活性研究有助于仙草黃酮保健食品以及調味食品的高效開發。