克東腐乳的研究進展

范洪臣，王冰，馬永強

(哈爾濱商業大學 省高校食品科學與工程重點實驗室，哈爾濱 150076)

腐乳因鮮美的味道、細膩的口感、獨特的風味、多樣的品種和豐富的營養，被國外譽為“東方奶酪”，是微生物發酵白豆坯而成的傳統食品[1]。根據顏色、風味與輔料的不同可將腐乳分成4大類：紅腐乳、白腐乳、青腐乳和其他類型腐乳[2]。腐乳中含有大量的蛋白質、多種氨基酸、礦物質和維生素等營養物質，營養價值較高[3]。根據菌種類型可將腐乳分為毛霉、根霉、細菌腐乳以及無菌腐乳[4]。黑龍江克東腐乳作為一種細菌型腐乳，在國內眾多腐乳中獨樹一幟，具有明顯的地域特色，與霉菌型腐乳相比，含有大量鮮味的氨基酸，更加鮮美的滋味、鮮艷的色澤，質構和風味有很大的區別[5]。本文對近些年細菌型發酵腐乳的代表——克東腐乳在生產工藝、微生物、酶、化學組分、風味、營養研究方面做一總結，并對克東腐乳的研究方向進行展望，為細菌型發酵腐乳的科研和生產提供了借鑒。

1 克東腐乳生產工藝

克東腐乳以黑龍江地產非轉基因大豆為原料，以微球菌為生產菌種，經過多道工序，長達6個月發酵，生產出的產品具有鮮艷的色澤、清香的味道、細膩柔軟的質地和豐富的營養。克東腐乳富含蛋白質及多種氨基酸，其中人體必需的氨基酸就有8種；富含多種維生素及微量元素，如鈣、鐵、鋅、硒等，是非常好的佐餐食品。克東腐乳加入了中草藥，產品亦有健脾補陽、溫中散寒、開胃止脹、解膻去膩、增進食欲、幫助消化等特點[6]。克東腐乳同其他發酵工藝類似，生產工藝流程見圖1。

圖1 克東腐乳生產工藝

腐乳生產過程復雜，包括一系列的物理化學和生物化學反應。從大豆的篩選、浸泡、磨漿、濾漿、煮漿，以酸或鹽點漿，到豆漿凝固后經壓榨瀝水成豆腐，然后切成適當的小塊成為白坯，都屬于物理化學過程[7]；白坯接種上微生物，經過微生物的前酵和后酵，產生特殊的質構和風味，此階段微生物生長代謝發生多種反應都屬于生化反應過程。腐乳的前酵過程包括菌種繁殖和酶解兩部分，菌種經一段時間生長繁殖后在白坯表面形成致密的菌膜，分泌的酶可將原料分解成蛋白質、肽、氨基酸和多糖等前體物質，為后酵提供原料[8]；后酵過程主要包括加鹽腌制和添加酒精輔料進行熟化兩部分，耐高滲透壓和酒精的多種微生物繼續降解坯體中蛋白質大分子物質，生成小分子肽、氨基酸及其他產物，與輔料中的化學物質協同作用生成醇、醛、酸、酯等呈香化合物，經過發酵后熟，腐乳形成了特有的色、香、味、體。

2 克東腐乳微生物研究

克東腐乳已有百余年歷史，其生產工藝以細菌型發酵而獨具特色。克東腐乳中菌種的確定與多樣性的研究經歷了一個漫長的過程，研究的方法主要有傳統微生物分離方法和變性凝膠電泳技術。

白虹等利用傳統的微生物分離方法，在25 ℃、pH 7.0液體發酵培養條件下，從克東腐乳中分離純化出3株菌，檢測其生長及產酶活力。微生物學研究表明菌A，B均產蛋白酶，A為革蘭氏不定型芽孢桿菌，B為革蘭氏陽性芽孢桿菌；菌C不產蛋白酶，為革蘭氏陽性微球菌[9]。此結論與王潤芝等研究的克東腐乳主要微生物類群是細菌的結論一致[10]。

平板分離鑒定微生物是傳統食品發酵微生物研究的主要手段，從樣品中篩選出純菌株后進行生理生化鑒定，確定樣品中存在的微生物種類及數量[11]。由于腐乳微生物復雜多樣，該方法只能篩選特定條件下的可培養微生物，占比例很大的不可培養微生物被忽略。因此，僅靠傳統培養方法不能全面揭示腐乳微生物的菌群結構。變性凝膠電泳技術克服了難培養或不可培養的新菌無法被研究和利用的缺點，能夠高效地獲取樣品中微生物群落指紋和特征性核苷酸序列，突破了腐乳中微生物多樣性研究的瓶頸，成為微生物多樣性和菌群結構變化的分子檢測技術之一，廣泛用于傳統食品發酵微生物多樣性的研究[12]。

馮鎮采用傳統平板分離技術和變性凝膠電泳技術研究了克東腐乳菌群的多樣性，采用傳統平板分離技術分離并鑒定出22種細菌，采用變性凝膠電泳技術鑒定出27種細菌，這兩種方法共同指出禽腸球菌(Enterococcusavium)、糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)、肉葡萄球菌(Staphylococcuscarnosus)是菌群中的主要優勢菌，腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)、巴黎鏈球菌(Streptococcuslutetiensis)、玫瑰色庫克菌(Kocuriarosea)、克氏庫克菌(Kocuriakristinae)、短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)、蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)是亞優勢菌。肉葡萄球菌(Staphylococcuscarnosus)、腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)、玫瑰色庫克菌(Kocuriarosea)、克氏庫克菌(Kocuriakristinae)屬于凝固酶陰性球菌，凝固酶陰性球菌很重要，因為這些細菌具有亞硝酸鹽和硝酸還原酶活性，促進腐乳紅色的形成和穩定，限制了脂質氧化和防止酸敗。糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)是克東腐乳菌群中的優勢菌，它也出現在奶酪和霉菌發酵的腐乳中，它是爭議比較大的一種菌，有些研究者認為該菌是受糞便污染的指示菌，另一方面有些研究人員也認為該菌影響著發酵產品的重要風味和作為生物保護劑。蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)是亞優勢菌，這兩種菌是意大利發酵香腸中的優勢菌，這些芽孢菌有高的蛋白酶和脂肪酶活性，并且很多研究者認為這兩種菌對人體的健康是有益的，因此這兩種菌可以作為克東腐乳的發酵劑[13]。

3 克東腐乳中酶的研究

腐乳釀造是由微生物主導的復雜的生化過程，微生物與其分泌的酶對腐乳口感和風味的形成、積累有重要的影響，尤其是多種蛋白酶、脂肪酶的相互協同作用。腐乳發酵過程中各地區微生物、發酵條件、發酵時間不同，產生的酶及性質也不同，所以各品牌腐乳的口感和風味差別也較大。

孫冰玉等以克東腐乳為研究對象，對其生產過程中堿性蛋白酶、中性蛋白酶以及谷氨酰胺酶活力進行監測并分析，結果表明：在腐乳前酵階段，坯體中堿性蛋白酶、中性蛋白酶及谷氨酰胺酶活力隨時間的增加而升高；在腐乳后酵階段，坯體和湯汁中堿性蛋白酶的活力隨時間的增加而下降，中性蛋白酶的活力隨時間的增加而升高，而湯汁中谷氨酰胺酶活力略有上升，坯體中谷氨酰胺酶的活力變化不顯著[14]。

4 克東腐乳生產過程中化學組分的變化

克東腐乳前酵過程中，占主要地位的微球菌及其他菌在白坯上生長繁殖，相互協同作用分泌并積累蛋白酶、脂肪酶，從而對原料中的蛋白質、脂肪進行水解，為后酵提供前體物。克東腐乳后酵過程中，菌的自溶、酶的分解作用、復雜的生物化學貫穿始終。菌體自溶及酶分解蛋白質形成的胨、多肽和氨基酸，微生物代謝產生的有機酸、醇類和酯類等，這些成分最終賦予了腐乳特殊的質構和風味。

鄒麗宏等以克東腐乳為研究對象，通過后酵生產過程中化學組分的變化，揭示各組分的變化規律，結果表明：在腐乳后酵階段，隨著發酵時間的增加，發酵導致坯體中的粗蛋白、粗脂肪含量下降，但湯汁中的粗蛋白、游離脂肪酸含量上升；坯體及湯汁中游離氨基酸態氮、總酸含量、還原糖含量上升；坯體及湯汁中pH下降；食鹽含量恒定，而水分含量變化明顯[15]。

5 克東腐乳揮發性風味研究

風味是腐乳品質和可接受性的重要感官屬性之一，揮發性風味成分是腐乳特殊風味的主要來源，主要由醇、酮、酸、醛、酯、醚和其他化合物組成，腐乳中除了揮發性風味物質還有非揮發性風味物質，如氨基酸、脂肪酸和呈味肽等，這些成分主要由微生物的氨基酸代謝、脂代謝、氧化還原反應、乙醇發酵、酸發酵、Strecker降解和美拉德反應形成[16]。目前克東腐乳中風味物質的提取方法有蒸餾-萃取法和固相微萃取法。

孫菁赫采用蒸餾萃取法提取揮發性風味物質，并結合氣相色譜-質譜聯用(GC-MS)技術對白坯、坯體和湯料的揮發性風味物質進行檢測，綜合分析了揮發性風味物質的種類及含量變化，結果表明：隨著發酵時間的增加，酸、醛、酮、醇等揮發性風味物質的種類和含量都增加；酯類是主要的風味物質，但酯類物質所占的百分比呈下降趨勢。

解春芝采用GC-MS技術測定8種腐乳樣品的游離脂肪酸譜，比較其游離脂肪酸的差異，并通過主成分分析法對其進行評價，結果表明：不同類型腐乳中，總游離脂肪酸含量為8.09～18.85 g/100 g，且存在顯著差異；共檢測出15種游離脂肪酸，亞油酸43.36%～50.74%、油酸22.29%～28.16%和棕櫚酸10.99%～13.72%為主要脂肪酸；這3種主要脂肪酸占總游離脂肪酸的98.71%，按游離脂肪酸含量的分值，克東腐乳在8種腐乳中排在第2位。究其原因：一方面，原料大豆和輔料中脂肪及游離脂肪酸含量存在差異，如克東腐乳主要以東北春大豆為原料，自然發酵型腐乳主要以云貴高原夏大豆為原料，而毛霉型腐乳由于分布廣泛，其原料的來源也較為多樣，包括黃淮海平原和長江流域夏大豆等；另一方面，不同腐乳的微生物區系不同，脂肪酶活力具有差異，進而導致脂肪的降解程度也不盡相同[17]。

6 克東腐乳營養成分及功能性研究

腐乳中功能性物質包括活性肽、不飽和脂肪酸、游離型大豆異黃酮以及不同種類的維生素和礦物質等。原料中的蛋白質和淀粉在微生物作用下發生改變，蛋白質和淀粉分別被分解成氨基酸、多肽和單糖、低聚糖，這些小分子化合物易被人體吸收，營養價值較高[18]。對克東腐乳的營養成分與功能性研究較少，目前只有王鶴霖等對克東腐乳中低聚肽進行了研究。王鶴霖分離、純化了克東腐乳中低聚肽，對其進行了抗氧化活性研究，結果表明：低聚肽分子量越大，抗氧化活性越強，低聚肽清除自由基能力最大可達38.68%，脂質體系抗氧化能力最大可達0.397 mg/kg[19]。

7 克東腐乳研究展望

克東腐乳是細菌發酵食品，同大多數霉菌發酵的腐乳相比，研究性論文數量較少。霉菌型腐乳在以下研究方面都有很大進展：氨基酸、多肽、不飽和脂肪酸、短鏈脂肪酸、B族維生素、大豆皂苷、大豆異黃酮等營養物質與功能的研究[20-25]；毛霉和根霉發酵條件對酶的影響[26]，蛋白酶與脂肪酶之間的相互關系[27-28]，酶活性變化[29]；霉菌型腐乳風味物質組成及變化規律[30-32]；毛霉和根霉發酵對腐乳品質的影響[33-34]；菌種多樣性的研究，尤其是高通量基因測序技術對腐乳菌群及風味之間關系的研究[35-38]。黑龍江克東腐乳地域特色明顯，與霉菌型腐乳相比，因較高的氨基酸含量使其滋味更加鮮美、質地柔軟而綿長；發酵過程中細菌代謝與霉菌代謝有很大的區別。因此，克東腐乳可以借鑒霉菌型腐乳的研究方法，在營養物質與功能、酶、風味物質、微生物組成與多樣性方面積極開展研究。