基于蛋白質組學分析側腦室微量注射GnIH對下丘腦蛋白的調節作用

王鳳霞，司麗娜，魏萌，楊松鶴，程露陽，喬躍兵

承德醫學院，河北承德 067000

下丘腦作為調控生殖和能量代謝的高級中樞，其分泌的促性腺激素釋放激素（GnRH）被認為是調節脊椎動物生殖的惟一下丘腦神經肽［1］。2000年，TSUTSUI團隊發現了一種可以抑制GnRH釋放的新型下丘腦神經肽——促性腺激素抑制激素（GnIH）。GnIH可通過其G蛋白偶聯受體GPR147作用于GnRH神經元，抑制促性腺激素合成和釋放［2］。本課題組前期實驗［3-4］表明，GnIH對GnRH、卵泡刺激素（FSH）、黃體生成素（LH）、Kisspeptin神經元和阿片—促黑素細胞皮質素原（POMC）起負向調節作用，對神經肽Y（NPY）起促進作用。可見GnIH是調節整個脊椎動物繁殖和神經內分泌系統不可或缺的要素［5］。但GnIH是否會對下丘腦的其他蛋白發揮調節作用有待進一步研究。本研究對卵巢摘除術補充雌激素（OEP）大鼠側腦室微量注射GnIH，運用液相色譜—串聯質譜（LC-MS/MS）和生物信息學分析探討GnIH對下丘腦蛋白質的影響。另外，經CPTAC數據庫檢索關鍵蛋白在激素相關性腫瘤中的表達情況，通過蛋白印跡檢測關鍵蛋白的表達，為探究GnIH與激素依賴性腫瘤的相關性提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 30只成年SD大鼠，雌性，SPF級，體質量200～250 g，購自北京華阜康實驗動物中心（合格證號：11401300016009），飼養于實驗動物中心。室溫維持在25℃左右，通風良好。SD大鼠循環光照12 h、自由飲水、攝食。本實驗所涉及的動物和實驗符合實驗動物倫理管理委員會的要求。

1.1.2 細胞 將人乳腺癌細胞系MCF-7置于含有10%胎牛血清和1%青鏈霉素的DMEM培養基中，并置于37℃、5%CO2、飽和濕度的恒溫培養箱中培養24 h，每2～3 d換液1次，待細胞長滿培養皿的80%～90%按1∶2～1∶3進行傳代，取對數生長期細胞進行相關實驗。

1.1.3 主要試劑與儀器 水合氯醛購于天津博迪化工股份有限公司，苯甲雌二醇購于寧波三生藥業有限公司，蛋白酶抑制劑（PMSF）購于北京博凌科為生物科技有限公司，GnIH購自美國Peprotech公司，大鼠腦立體定位儀購自日本Narishige公司，D3024R型臺式高速冷凍離心機購自北京大龍公司，Dionex Ultimate 3000 Nano LC system納升液相色譜系統購于美國戴安公司，DMEM培養基、胰蛋白酶購于美國Gibco公司，Biological Industries（BI）特級胎牛血清購于以色列生物科技公司，兔單克隆抗體GAPDH、ADPGK分別購于Abcam和Abclon公司，化學發光圖像分析系統購自上海天能公司，電泳儀購自北京六一儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型構建及下丘腦蛋白樣本制備 大鼠行雙側卵巢摘除術14 d后，連續5 d皮下注射雌激素0.1 mg/（kg·d），建立OEP大鼠模型。保持大鼠體內雌激素釋放水平一致，避免雌激素波動對GnIH的負反饋作用。造模成功后隨機分為實驗組和對照組，各15例。根據《The Rat Brain in Ttereotaxic Stereotaxic Coordinates》（第三版）的方法進行側腦室定位：前囟點后1.0 mm，旁開1.5 mm，進針深度4.0 mm，實驗組和對照組分別注射GnIH和生理鹽水（4μL/只，2μg/μL），每30 s注射0.5μL，于4 min完成注射。給藥6 h后取出下丘腦，用PBS清洗并稱重。將下丘腦組織放入研磨儀中，加入組織裂解液和PMSF，低溫研磨，制成勻漿，于4℃12 000 r/min離心30 min，取上清液，-80℃儲存備用。

1.2.2 液相色譜質譜數據分析 將下丘腦蛋白樣品酶解，經Dionex Ultimate 3000 Nano LC system納升液相色譜系統進行LC-MS/MS分析。色譜柱：Thermo Fisher C18；流動相中A：水，0.1%FA，B：乙腈，0.1%FA；色 譜 柱 類 型C18，規 格100 mm×75 mm，孔徑300 A，粒徑5μm，流速400 nL/min；梯度：0～65 min，B液線性梯度從5%到80%；0～58 min，B液線性梯度從80%到5%；55～65 min，A液保持100%不變。經色譜分離后用Q-Exactive質譜儀進行ESI質譜鑒定。分析時長：65 min，檢測方式：正離子，母離子掃描范圍：300～1800 m/z；一級質譜分辨率：70 000@m/z 200；二級質譜分辨率：17 500@m/z 200；多肽和多肽的碎片質量電荷比按照下列方法采集：每次全掃描后采集20個碎片圖譜，得到LC-MS/MS原始數據，用Maxquant-1.5.2.0對肽段進行非標記蛋白質組學定量分析。

1.2.3 差異蛋白的生物信息學分析 本研究對非標記LC-MS/MS質譜分析檢測的原始數據，以P＜0.05且差異表達倍數≥2為標準，利用Omicsbean（http：//www.Omicsbean.cn）多組學在線數據分析平臺對差異蛋白進行基因本體（GO）分析和京都蛋白與蛋白組百科全書（KEGG）通路富集分析。GO分析包括生物過程（BP）、細胞成分（CC）和分子功能（MF）。

1.2.4 蛋白相互作用網絡圖構建 本實驗基于String（https：//string-db.org/）在線數據庫檢索差異蛋白，構建蛋白—蛋白相互作用（PPI）關系網絡，獲取蛋白互作數據。將數據上傳至Omicsbean（http：//www.Omicsbean.cn）多組學在線數據分析平臺，得到PPI關系網絡。

1.2.5 腫瘤中關鍵蛋白表達鑒定 經生物信息學分析得到的關鍵蛋白，聯合應用UALCAN數據庫中CPTAC分析程序，輸入關鍵蛋白名稱，CPTAC數據庫選擇乳腺癌，點擊搜索，可顯示蛋白在癌組織與癌旁組織的表達情況。

1.2.6 關鍵蛋白ADPGK表達檢測 應用Western blotting法對關鍵蛋白ADPGK表達進行檢測。取MCF-7對數生長期細胞懸液，按GnIH給藥濃度（0、1 000、10 000 ng/mL）接種于底面積為21 cm2的培養皿中，37℃、5%CO2培養箱中培養24 h后加藥。繼續培養24 h，取出各組細胞培養皿，吸棄培養基，用4℃預冷的PBS清洗，加適當體積的含PMSF的RIPA裂解液于-80℃冰箱過夜。冰上裂解30 min，收集細胞懸液，置于4℃低溫高速離心機中以12 000 r/mim離心15 min，取上清。根據BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。取蛋白上清1/4的Loading Buffer與上清液充分混合，100℃干式孵育器煮10 mim，使蛋白變性，冷卻至室溫-20℃保存。用12%SDS-PAGE電泳分離蛋白樣本（20μg），分離后電流設定200 mA恒流轉至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。取相應特異性一抗（GAPDH 1∶10 000、ADPGK 1∶2 000）孵育2 h，4℃過夜，復溫30 min，TBST洗膜緩沖液洗3次，加入HRP熒光標記的二抗（1∶8 000），室溫孵育1 h，洗膜后加入ECL特超敏試劑，經Tanon 6100凝膠成像儀掃描顯影。采用Image J軟件分析，通過目標蛋白灰度值與內參蛋白灰度值的比值來確定目標蛋白的相對表達水平。

1.2.7 統計學方法 所有圖表用GraphPad Prism 8制作，實驗數據采用GraphPad Prism 8軟件進行分析。計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，方差齊時兩兩比較采用LSD法，方差不齊時兩兩比較采用DunnettT3法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 OEP大鼠模型下丘腦組織中差異蛋白鑒定結果 鑒定出253個差異蛋白，其中129個蛋白（A0A0G2JZR4、 A0A0G2K1D2、 A0A0G2K1J5、A0A0G2K1R5、 A0A0G2K272、 A0A0G2K4N7、A0A0G2K508、 A0A0G2K562、 A0A0G2K5Q0、A0A0G2K5Q2、 A0A0G2K6I0、 A0A0G2K774、A0A0G2K7G7、 A0A0G2K7T5、 A0A0G2K8K0、A0A0G2KAL4、A0A0G2KAW7、A0A0G2KAZ2、A0A0H2UHA6、A0A5D0、A1L114、B1WBM0、B1WC61、B2RYG2、B2RYS8、B3SVE9、B5DF03、C9E895、D3Z955、D3ZA84、D3ZAI6、D3ZCA0、D3ZCI5、D3ZCL8、D3ZHI9、D3ZJK8、D3ZQD3、D3ZVR7、D4A1V1、D4A4P3、D4AA52、D4ACX8、E9PSK7、E9PSL7、F1LNG7、F1LP22、F1LP76、F1LRE1、F1LRT9、F1LUE2、F1M471、F1M5C9、F1M5R3、F1M754、F1MAM6、F2Z3T7、F7EMK8、F8V328、F8WFP9、F8WFS9、G3V734、G3V784、G3V7X2、G3V8G6、G3V918、G3V9S0、M0R6K0、M0R6N2、M0RC99、O09178、O35180、O54755、O88954、P01835、P07153、P09034、P09527、P11348、P11505、P11884、P16446、P18163、P20171、P20760、P21816、P23928、P30835、P34926、P41565、P45479、P62632、P62890、P70549、P84586、P85515、Q03555、Q1W1V7、Q499Q4、Q4QR85、Q5BK32、Q5EBD0、Q5M963、Q5M9F7、Q5XIG8、Q5XIT9、Q5XIW9、Q63604、Q66HG4、Q66HM7、Q68FU2、Q68FX9、Q68G11、Q68G16、Q6AY09、Q6AY30、Q6AYU3、Q6IN14、Q6IRK9、Q6NYB7、Q6P7S1、Q6P7S6、Q8CG45、Q99N27、Q9ERC1、Q9R140、Q9WVJ4、R9TL61）上調，124個蛋白（A0A0G2JW58、A0A0G2JW 92、A0A096MJD3、A0A0G2JTG7、A0A0G2JW88、A0A0G2JXC3、 A0A0G2JYW3、 A0A0G2JZM2、A0A0G2K079、 A0A0G2K1A5、 A0A0G2K327、A0A0G2K3P4、 A0A0G2K5C6、 A0A0G2K5E6、A0A0G2K6J5、 A0A0G2K7Y2、 A0A0G2K8I0、A0A0G2K8K9、 A0A0G2K930、 A0A0H2UI35、A0JN17、A1A5L2、A1L1M0、A8WCF8、B0BN18、B2RYJ7、B2RZ79、B3GS92、B3VQJ0、B5DFE0、B6DTP5、D3Z8H0、D3ZGQ3、D3ZIL6、D3ZLH9、D3ZLT1、D3ZRI1、D3ZSL2、D3ZTW9、D3ZUP5、D3ZXF9、D3ZZK3、D3ZZQ0、D4A3B0、D4A4D5、D4A8B3、D4AAF8、D4AE96、E9PSV5、F1LN88、F1LP21、F1LRW6、F1LUV9、F1LX47、F1M7Y3、F7ES73、F7ESM5、F7FKI5、F8WFH8、F8WFM2、G3V6L9、G3V6P7、G3V6S2、G3V803、G3V984、G3V9G3、G3V9Z6、I6L9G6、M0R7Q5、M0R9X8、M0RCV0、O35509、O70419、P04218、P07171、P10362、P11275、P13383、P13852、P20651、P35332、P36201、P51583、P59649、P60522、P62630、P62963、P68403、P97532、Q05140、Q1RP74、Q4KLJ1、Q4KM71、Q4V8E2、Q4V8I7、Q5BJU0、Q5HZV9、Q5RJL0、Q5U1Z9、Q5XI72、Q5XIJ3、Q62861、Q63092、Q63798、Q64538、Q66HM2、Q6DGF2、Q6DUV1、Q6P685、Q6P783、Q6P7A7、Q6S399、Q6XVN8、Q7TQ77、Q7TSD7、Q80W98、Q80Z30、Q810D0、Q920Q0、Q9ERD1、Q9JKT0、Q9QUH6、Q9QXY2、R9PXS4、R9PXU4、R9PXW7）下調。

2.2 OEP大鼠模型下丘腦組織中差異蛋白的GO功能富集分析 BP有540個條目顯著富集（P＜0.05），CC有174個條目（P＜0.05），MF有184個條目（P＜0.05），見表1。

2.3 OEP大鼠模型的下丘腦差異蛋白的KEGG通路富集分析 KEGG通路富集與本研究關系較密切的是代謝途徑、糖酵解/糖原異生、內分泌和其他因子調節的鈣重吸收、半乳糖代謝等10條主要通路（表2）。

2.4 下丘腦PPI網絡 有51個節點蛋白和92條蛋白相互作用關系，代謝途徑中有NDUFB8、NDUFB7、OGDHL、FAM213B、NDUFB3、ALDH2、ADPGK、GART、AMPD3、RPN1、ASS1、QDPR、ACSL1、CDO1、PFKL、PPT1、PAICS、MPST、PGM1、CMAS、MCCC2、GALM、ASAH1；糖酵解/糖異生中有ALDH2、ADPGK、PFKL、PGM1、GALM；內分泌和其他因子調節的鈣重吸收中有PRKACA、CALB1、ATP2B1、AP2A2；半乳糖代謝中有PFKL、PGM1、GALM；軍團菌病中有EEF1A1、EEF1A2、RAB1A；長 時 程 增 強 中 有PRKACA、CAMK2A、HRAS；壽命調解途徑—多物種中有PRKACA、HRAS、CRYAB；戊糖磷酸途徑中有PFKL、PGM1；亨 廷 頓 病 中 有NDUFB8、NDUFB7、IFT57、NDUFB3、AP2A2；朊病毒病中有PRKACA、PRNP。綜合分析GO、KEGG和PPI顯示，差異蛋白GALM、ADPGK、PGM1、PFKL和ALDH2同時富集于代謝途徑和糖酵解途徑，其中GALM、ADPGK、PGM1、PFKL為上調蛋白，ALDH2為下調蛋白。

2.5 CPTAC數據庫中關鍵蛋白在乳腺癌及正常乳腺組織中的表達比較 節點蛋白GALM、ADPGK、PGM1、PFKL和ALDH2在乳腺癌組織中的表達高于正常乳腺組織，PGM1（P=0.250 0）蛋白表達高低與乳腺癌患者總體生存期無關，GALM（P=0.050 0）、ADPGK（P=0.006 0）、PFKL（P=0.006 2）和ALDH2（P=0.009 2）的高表達與患者總體生存期有關。

表1 下丘腦組織中差異蛋白的GO功能富集分析

表2 KEGG富集的10條主要信號通路

2.6 GnIH對乳腺癌細胞系MCF-7中ADPGK表達的影響 0、1 000、10 000 ng/mL GnIH作用MCF-7細胞中ADPGK蛋白相對表達量分別為1.08±0.02、1.17±0.06和1.29±0.16，0與10 000 ng/mL濃度比較P＜0.05。

3 討論

哺乳動物以下丘腦—垂體—性腺軸為主導，通過神經內分泌系統相互協調且規律地進行著繁殖生理活動［6］。GnIH作為下丘腦—垂體—性腺軸中的重要負向調控因子，對生殖神經內分泌系統發揮重要的調控作用。

本研究對OEP大鼠行側腦室微量注射GnIH，取下丘腦制備蛋白勻漿，基于非標記定量的蛋白質組學，共篩選出差異蛋白253個，其中129個蛋白顯著上調，124個蛋白顯著下調。GO結果顯示，差異蛋白在細胞質和細胞核有富集，參與單體和小分子代謝過程，并且主要與小分子相互作用，可以和細胞內特異性轉運系統作用對體內各種生理功能產生影響。KEGG結果表明，參與腫瘤發生發展的信號通路糖酵解途徑在下丘腦差異蛋白中呈現顯著差異性。綜合考慮蛋白的差異變化程度以及蛋白間相互作用的情況，從PPI蛋白互作網絡篩選出GALM、ALDH2、ADPGK、PGM1、PFKL為關鍵節點蛋白，且其共同參與腫瘤相關的糖酵解途徑。

糖酵解途徑作為代謝途徑之一，與腫瘤［7］、生殖［8］和神經內分泌系統［9］有關，并為機體提供生命活動所需能量。在激素依賴性乳腺癌的研究中發現，癌細胞的葡萄糖攝取通過激活糖酵解表型而增加癌基因Akt的表達，Akt激酶活性的增加大多與預后不良有關［10］。結合本實驗的差異蛋白富集糖酵解通路結果，推測GnIH可能通過糖酵解途徑影響激素依賴性相關生殖神經內分泌系統疾病。在生物體中，蛋白質并不是獨立存在的，其功能的行使必須借助于蛋白質間的相互作用來調節和介導［11］。磷酸果糖激酶（PFK）是糖酵解途徑中最關鍵的限速酶，且PFK分為PFKM、PFKL和PFKP三種亞型，PFKL是篩選出的節點蛋白。研究表明，PFKL過表達導致葡萄糖攝取增加和乳酸的產生，促進糖酵解［12］。另有研究發現，抑制PFKL的表達會抑制細胞增殖和致瘤性，如在雌激素相關的乳腺癌中發現雌激素通過激活PI3K-Akt途徑刺激糖酵解，誘導PFKL表達增加，促進乳腺癌的發生［13-14］。ALDH2作為一種乙醇代謝重要的酶，處于糖酵解/糖異生信號通路的核心位置［15-16］。ALDH2活性的降低和由此產生的較高濃度的乙醛可能是乙醇誘發癌癥的危險因素［17］。研究發現，在飲酒誘發的卵巢癌［18］和乳腺癌［19］中，ALDH2表達下調，導致乙醛暴露增加，從而促進癌癥的發生發展。除了對腫瘤產生影響外，在神經內分泌系統也發揮著作用。研究顯示，ALDH2表達增高可促進瘦素［20］和促黑素細胞皮質素原［21］表達增高。PGM1是糖酵解途徑中的關鍵酶，通過催化1-磷酸葡萄糖和6-磷酸葡萄糖的相互轉化維持葡萄糖穩態［22］。研究發現，組織細胞發生癌變時需要攝取大量葡萄糖，PGM1在激素依賴性子宮內膜癌組織中高表達，PGM1為腫瘤細胞持續生長提供能量［23-24］。此外，在人類卵巢巨噬細胞中發現，PGM1表達增多可促進黃體退化，說明PGM1與雌孕激素的分泌和釋放密切相關［25］。ADPGK利用ADP作為磷酸供體催化葡萄糖非陽離子磷酸化為葡萄糖6-磷酸［26］，參與糖酵解途徑對能量代謝起關鍵作用。研究發現，在激素依賴性腫瘤的前列腺癌和乳腺癌中ADPGK高表達，ADPGK高表達可以驅動糖酵解使葡萄糖攝取增加，促進腫瘤的增殖、遷移和侵襲［27-29］。GALM是參與半乳糖調節的重要相關酶。研究發現，GALM對人癌細胞生長有較強的抑制作用，且呈劑量依賴性，其機制可能與Caspase-12的表達增加有關［30］。

乳腺癌屬于激素依賴性腫瘤，雌激素與乳腺癌的發生發展密切相關。本實驗選用雌激素受體陽性乳腺癌MCF-7細胞系驗證，經GnIH作用后下丘腦關鍵蛋白ADPGK與MCF-7細胞系的ADPGK蛋白表達及功能行使是否一致，探索GnIH與激素依賴性腫瘤之間的關系。研究顯示，ADPGK可催化葡萄糖-6-磷酸的生成，葡萄糖-6-磷酸是所有生命代謝的中心反應［26］。在組織水平，側腦室微量注射GnIH后蛋白質組學和生物信息學分析顯示下丘腦差異蛋白ADPGK表達上調，促進糖酵解使下丘腦獲得足夠的能量并加速代謝。另有研究表明，ADPGK在腫瘤細胞中表現出促生存和抗凋亡作用［31］。在細胞水平，GnIH給藥后經蛋白免疫印跡驗證MCF-7細胞中ADPGK蛋白相對表達水平下降，與其他研究者結果一致。從以上結果可推測，在正常組織中GnIH可能通過糖酵解途徑上調下丘腦蛋白ADPGK促進代謝，而在腫瘤細胞中GnIH可發揮抑制ADPGK蛋白的表達達到促進MCF-7細胞凋亡的作用。

綜上可見，GnIH通過參與葡萄糖攝取的糖酵解途徑，影響GALM、ADPGK、PGM1、PFKL和ALDH2的表達，之后經過一系列神經內分泌反饋調節促性腺激素合成和釋放以支持生物體活動，這可為神經內分泌系統疾病的激素依賴性腫瘤的診斷與治療提供更多的策略。