鼻咽癌患者外周血循環腫瘤細胞與臨床分期的相關性研究

黃偉義 梁錦輝 劉家豪 鄧濱 程宇文 黎彩玲 劉園源 羅泳林 李靖 顏建業

（廣西梧州市紅十字會醫院 廣西梧州 543200）

鼻咽癌是頭頸部常見的惡性腫瘤之一，與其他惡性腫瘤相比，鼻咽癌5年總存活率可達70%～80%[1]。然而晚期鼻咽癌患者5年存活率還有待提高，而遠處轉移及局部復發是影響晚期鼻咽癌預后的重要因素[2]。CTCs是指從原發部位脫落并經血液循環傳播至身體各處的癌細胞[3]。CTCs進入外周血后會隨血液運行黏附及侵襲血管壁，進入組織實質并進行細胞分裂增殖，最終實現病灶轉移[4]。最新研究顯示[5-7]，CTCs與肺癌、胃癌、結直腸癌等多種惡性腫瘤病情進展及預后有關，而關于CTCs與鼻咽癌臨床分期的關系目前研究仍較為有限。因此，本研究將分析CTCs與臨床分期的關系，旨在為鼻咽癌遠處轉移風險評估提供參考，為對鼻咽癌遠處轉移早期干預提供依據。現在報告如下。

1 資料及方法

1.1臨床資料 選取梧州市紅十字會醫院2018年6月至2019年12月收治的100例首診無遠處轉移鼻咽癌患者為研究對象，納入標準：經病理組織學確診；患者入組前未接受過手術或局部放化療治療；預計生存期限＞6個月。另選取100例慢性鼻炎患者為對照組，排除標準：合并其他惡性腫瘤；合并心肝腎等臟器功能衰竭；患者不愿意配合本次研究。其中男52例，女48例；年齡28～75歲，平均（48.5±4.7）歲；病理類型：低分化型35例，中分化型45例，高分化型20例；T分期：T1 9例，T2 17例，T3 35例，T4 42例；N分期：N0 8例，N1 14例，N2 46例，N3 33例；臨床總分期：Ⅰ期8例，Ⅱ期15例，Ⅲ期27例，Ⅳa期49例。

1.2方法

1.2.1 CTCs檢測方法。鼻咽癌及對照組患者入組后于次日清晨空腹采集第一管外周血行其它項目檢測，第二管采集5mLEDTA抗凝外周血用于CTCs檢測，以避免穿刺過程中皮膚上皮細胞的污染。CTCBIOPSY檢測系統購自武漢友芝友醫療科技有限公司，以微孔濾膜過濾法（ISET）分離外周血CTCs，采用專用的細胞染色液進行染色。在光學顯微鏡下觀察CTCs形態學特征：（1）細胞體積較大，呈圓形、橢圓形或梭形，長徑多大于10μm；（2）細胞核異型性，呈折疊、扭曲、結節或分葉狀等；核深染且著色不均勻，核膜增厚，出現凹陷或褶皺；核偏位，或巨大核仁；（3）核質比異常，多大于0.8。同一個標本中符合上述標準的細胞≥2個為CTCs陽性。

1.2.2EBERs原位雜交。EBERs原位雜交試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。將貼有濾膜的載玻片依次放入100%乙醇、95%乙醇、75%乙醇中脫色；0.4%胃蛋白酶消化10分鐘；EBERs探針雜交過夜；信號檢測采用過氧化物酶結合抗地高辛抗體和3,30-二氨基聯苯胺（DAB）；蘇木精復染。陽性信號呈棕黃色，局限于細胞核內。

1.2.3 MRI評估淋巴結轉移。采用MRI評估患者淋巴結轉移情況，取TSE序列，掃描方向為冠狀面、矢狀面、橫斷面，掃描范圍從鞍上池至胸鎖骨，掃描參數：層厚/層距為5 mm/1.5 mm，T1W1 TR/TE=400～600/15～25 ms；T2W1：TR/TE=1800～3000/90～150 ms，有以下情況視為淋巴結轉移：淋巴結包膜外侵犯；橫斷面上圖像淋巴結直徑≥10 mm；同一區域內淋巴結呈簇狀個數≥3個，且淋巴結最小直徑≥8 mm；淋巴結中間出現液化壞死，邊緣環狀強化。

1.3統計學方法 采用SPSS21.0軟件對數據進行分析，計數資料采用百分比（%）表示，用百分數和例數表示計數資料，組間比較采用X2檢驗，相關性分析采用Spearman單因素分析。

2 結果

2.1鼻咽癌患者與對照組外周CTCs比較 鼻咽癌患者CTCs陽性表達率為62%，而對照組CTCs陽性表達率為0.0%，比較有統計學意義（P＜0.05）。見表1，圖1。

表1 鼻咽癌患者與對照組外周血CTCs比較（例，%）

2.2鼻咽癌患者外周血CTCs陽性率與患者臨床特征的關系 鼻咽癌患者CTCs在N0～N1分期與N2～N3分期中陽性表達率存在差異（P＜0.05）。鼻咽癌患者CTCs在T分期中陽性表達率無統計學差異（P＞0.05）。鼻咽癌患者CTCs在臨床總分期Ⅰ～Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳa期中存在差異（P＞0.05）。鼻咽癌患者CTCs在淋巴轉移和無淋巴轉移中存在差異（P＜0.05）。見表2。

表2 鼻咽癌患者外周血CTCs陽性率與患者臨床特征的關系（例，%）

2.3鼻咽癌外周血CTCs與臨床分期、淋巴結轉移的相關性分析 經Spearman相關性分析可知，鼻咽癌外周血CTCs陽性率與N分期、臨床總分期及淋巴結轉移呈正相關（P＜0.05），而與T分期不相關（P＞0.05）。見表3。

表3 鼻咽癌外周血CTCs與臨床分期、淋巴結轉移的相關性分析

3 討論

隨著鼻咽癌患者病情進展，部分癌細胞可發生表型轉化，由原來病灶播散到淋巴系統、血循環系統、骨髓系統中，但尚未形成病灶轉移，僅發生腫瘤微轉移，當微轉灶隨血液在靶器官血管壁附著時即發生遠處轉移，大大降低了患者存活率[8-9]。臨床常規檢查難以發現腫瘤病灶微轉移，因此容易導致部分腫瘤細胞脫落原病灶，并在特定條件下被激活而形成轉移病灶[10]。腫瘤細胞從原病灶組織中脫落進入血液后，會受到自身凋亡、血流切變力、體內免疫力等作用，會導致大量癌細胞侵襲力減弱或凋亡，只有獲得高侵襲性、高成瘤能力的癌細胞才具備遠傳轉移的可能，這意味著CTCs具備了逃逸免疫監測及干細胞的生物學特性。由于鼻咽癌患者的腫瘤細胞基本都帶有EB病毒基因組，EBERs被認為EB病毒潛伏感染的最好標志物[11-12]。通過微孔過濾裝置將外周血中的CTCs從血細胞中分離并富集，后續應用原位雜交技術檢測細胞內EBERs，可以準確鑒定出真正的鼻咽癌CTCs，確定鼻咽癌CTCs的形態特征[13]。

目前多項研究表明[14]，外周血CTCs陽性與腫瘤分期有密切的關系，患者外周血中CTCs數量越多，患者面臨腫瘤細胞遠處轉移的風險越大。本研究結果顯示，鼻咽癌患者外周血CTCs陽性率為62%，100例慢性鼻炎患者外周血CTCs陽性率為0，表明CTCs是腫瘤患者特有的標志物。G Kallergi等[16]應用改良免疫磁珠富集聯合免疫熒光細胞技術檢測鼻咽癌患者外周CTCs，患者陽性率為82.9%，高于本研究結果，這可能與CTCs檢測方法有關。本研究檢測方法采用磁珠富集腫瘤細胞結合免疫熒光法及熒光原位雜交技術進行監測，不受腫瘤細胞上皮標志物表達影響，提高了CTCs檢測準確性及靈敏性。鼻咽癌N分期是用于評價腫瘤區域淋巴結轉移風險，分期越高提示區域淋巴結轉移風險越高，原發腫瘤細胞經淋巴管進入血液的風險越大。T分期是用于評價腫瘤侵犯黏膜層及鄰近結構情況，分期越高提示局部復發風險越高，原發腫瘤細胞經血管進入血液的風險越大。臨床總分期越高提示腫瘤侵襲性越高，患者治療后局部及淋巴結殘留風險越大，因此增加患者局部復發及遠處轉移風險。預后差。本研究經Spearman相關性分析可知，鼻咽癌外周血CTCs陽性率與與N分期、臨床總分期呈正相關（P＜0.05），表明鼻咽癌患者外周血CTCs與N分期、臨床分期有密切的關系。提示鼻咽癌患者外周血CTCs陽性者有更高的局部復發及遠處轉移風險。另本研究發現，鼻咽癌患者外周血CTCs與T分期無相關性（r=0.101，P＞0.05），提示鼻咽癌患者外周血CTCs陽性對局部復發風險評估價值較低。

總之，鼻咽癌外周血CTCs與N分期、臨床分期及淋巴結轉移有一定的關系，可作為鼻咽癌局部復發及遠處轉移風險的輔助評價指標，相比較而言，其對遠處轉移風險評估價值較高。但腫瘤轉移的發生是一個復雜的生理調控過程，腫瘤細胞進入血循環只是病灶轉移發生的一部分，CTCs進入血液后需吸附在血管上并侵入靶器官組織，最后完成增殖才形成轉移灶。因此對CTCs進行研究時，除了對CTCS進行定性外，還需要對CTCs進行定量研究，這是由于CTCs數量越多，最終存活的CTCs數量越多，最終發生遠處轉移的幾率越高。而本研究僅對CTCs進行定性分析，缺乏定量分析，因此在日后研究中還需要對研究進一步完善。