卡博替尼與血清白蛋白的相互作用研究

王曉芳，孫 亮，王 雷，梁 棟，鄂詩瑀，徐誠煒，王家歡，劉 彬

(遼寧大學 藥學院，遼寧 沈陽 110036)

0 引言

卡博替尼(CBZ)是一種小分子多靶點酪氨酸梅抑制劑，廣譜抗腫瘤藥，用于治療甲狀腺髓樣癌、腎細胞癌、前列腺癌、晚期肝癌等疾病.但是，使用不當可引起出血、胃腸穿孔、高血壓、血栓栓塞、腹瀉、嘔吐等不良反應[1].血清白蛋白是人與動物血漿中含量最豐富的蛋白質，它在生物體中起著血液緩沖劑、維持血液滲透壓、載運等作用，藥物吸收后最先會與其結合.因此，研究藥物與血清白蛋白的相互作用，對于了解藥物在生物體內的存在狀態、運輸、吸收、代謝及藥理作用具有重要意義.而牛血清白蛋白(BSA)與人血清白蛋白有70%以上的同源性，因此BSA常被用來代替人血清白蛋白被選作模型蛋白[2].

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

紫外-可見分光光度計(UV-2550型，日本島津公司)；熒光光譜儀(F-7000型，日本日立公司)；CBZ(遼寧大學藥學院藥物化學研究室自制)；BSA(上海麥克林生化科技有限公司)；三羥甲基氨基甲烷(Tris：生化試劑，國藥集團化學試劑有限公司)；氯化鈉(沈陽新化試劑廠)；其他試劑均為市售分析純，實驗用水為雙蒸水.

1.2 實驗方法

首先，用pH=7.4的NaCl-Tris-HCl緩沖液配制實驗中所需的各種溶液.室溫下，在200～600 nm范圍內，分別掃描濃度為1.0×10-5mol·L-1的CBZ溶液、BSA溶液和上述溶液等體積混合后生成的CBZ-BSA混合溶液紫外光譜.然后，采用熒光滴定法考察CBZ與BSA間相互作用.將不同體積1.0×10-3mol·L-1的CBZ溶液逐步滴加到裝有2.5 mL 1.0×10-5mol·L-1BSA溶液的1 cm石英比色皿中(滴定劑累加體積不大于0.05 mL)，每次加入CBZ溶液后混合均勻，靜置5 min后，于278 nm激發波長下進行熒光掃描.發射與激發狹縫寬度均為5 nm，掃描波段范圍200～800 nm，掃描速度1 200 nm·min-1.

2 結果與討論

2.1 CBZ與BSA相互作用的紫外光譜

圖1 BSA、CBZ及CBZ-BSA混合體系的紫外光譜1.CBZ；2.BSA；3.BSA+CBZ；4.CBZ-BSA混合溶液([BSA]=[CBZ]=1.0×10-5 mol·L-1)

有文獻報道[3]，動態淬滅只影響到熒光體分子的激發態，并不改變熒光體的吸收光譜；相反在靜態淬滅中，基態配合物的生成往往會導致熒光體的吸收光譜的改變.圖1為CBZ、BSA及CBZ-BSA體系的紫外吸收光譜圖.

由圖1可見，CBZ的加入不僅使BSA在278 nm處的吸收峰強度升高，而且CBZ-BSA復合體系的吸收光譜與單獨CBZ和BSA吸收光譜的數學加和不一致(圖中虛線)，說明該現象的發生不是CBZ與BSA簡單混合導致的，而是CBZ的確與BSA的基態分子發生了相互作用，形成了基態配合物，從而初步推斷CBZ很可能使BSA發生靜態淬滅[4].

2.2 CBZ與BSA相互作用的熒光光譜

BSA分子中含有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等內源性熒光的物質，因此熒光光譜經常用來研究藥物與BSA分子之間的相互作用.由圖2可見，隨著CBZ濃度增大，BSA的最大發射熒光峰強度逐步降低，稱為熒光淬滅，同時也表明CBZ與BSA之間存在相互作用.熒光淬滅過程一般分為靜態淬滅和動態淬滅，通常可借助動態淬滅常數的大小及溫度對淬滅過程的影響判斷其淬滅類型.應用Stern-Volmer方程對CBZ引起BSA熒光淬滅的數據進行處理[5]：

圖2 CBZ與BSA相互作用的熒光光譜([BSA]=1.0×10-5 mol·L-1)

F0/F=1+KSV[Q]

(1)

其中，F和F0分別代表加入和不加CBZ時BSA的熒光強度，KSV為動態淬滅常數，[Q]為CBZ濃度.根據圖2中343 nm處的熒光強度變化值，由式(1)作出BSA熒光淬滅的Stern-Volmer曲線，再根據直線斜率及截距可求出不同溫度CBZ與BSA相互作用的KSV，5.2×104L·mol-1(293K)；5.4×104L·mol-1(303K)；5.7×104L·mol-1(310K).數值均在104數量級，說明CBZ對BSA有極強的淬滅作用.隨著反應體系溫度的升高，KSV略有升高，表明CBZ與BSA的激發態分子間發生相互作用，并且在相互碰撞過程中會發生能量轉移或電子轉移，從而引起BSA熒光發生動態淬滅.綜上，CBZ與BSA間相互作用很可能是一個聯合淬滅過程.一般講，對于聯合淬滅過程，可以用修正Stern-Volmer方程來驗證[6].

F0/F=(1+KD[Q])(1+KS[Q])=1+(KD+KS)[Q]+KDKS[Q]2

(2)

式中KD為動態淬滅常數，KS靜態淬滅常數，其它參數含義同公式(1)，繪制修正Stern-Volmer曲線，見圖3.如圖所示，可看到三條微向下彎曲的曲線，進一步確證BSA的熒光淬滅機理為聯合淬滅[6-7].

圖3 修正的Stern-Volmer曲線

2.3 CBZ與BSA的相互作用模式

結合常數和結合位點數通常用來描述分子之間相互作用模式，該項參數可由公式(3)修正的雙對數方程獲得.

lg[(F0-F)/F]=nlgKa+nlg{[Q]-n[P](F0-F)/F0}

(3)

式中的[Q]、[P]分別為CBZ和BSA的總濃度，n為結合位點數，由式(3)作lg[(F0-F)/F]-lg[Q]圖，可根據圖中直線的斜率及截距計算不同溫度下CBZ與BSA表觀結合常數Ka和結合位點數n.計算結果為T=293 K，Ka=5.06×104L·mol-1，n=0.913 7；T=310 K，Ka=4.34×104L·mol-1，n=0.730 1，表明CBZ和BSA分子之間具有較強的相互作用，且形成1∶1形式的配合物.進一步，根據熱力學公式(4)和(5)可以求得結合反應的熱力學參數ΔG=-26.39 kJ mol-1、ΔH=0.945 kJ·mol-1、ΔS=92.28 J·mol-1·K-1.

lnKa=-ΔH/RT+ΔS/R

(4)

ΔG=-RTlnKa=ΔH-TΔS

(5)

ΔG<0表明CBZ與BSA的相互結合是自發的，同時，ΔH和ΔS均為正值，這表明CBZ與BSA之間的主要作用力是疏水作用[7].

3 結論

本研究借助紫外光譜法、熒光光譜法和熱力學理論等手段，考察了CBZ與BSA之間的相互作用.結果發現，CBZ可以使BSA內源性熒光發生淬滅，其淬滅類型屬于動、靜態聯合方式.此外，在CBZ分子與BSA間存在較大相互作用，且其主要依靠疏水作用力生成1∶1形式的配合物，該研究對于從分子水平上研究CBZ合理應用具有重要意義.