基于網絡藥理學分析黃芩-槐花藥對治療高血壓的作用機制*

管怡晴，陳凱，田元新，全東令，張靜茹，呂琳，張國華

(南方醫科大學1.中醫藥學院；2.藥學院，廣州 510515)

“黃芩-槐花”藥對是張國華教授在多年臨床實踐中，用于治療高血壓的常用配伍組合，其臨床降壓療效明確，然而目前關于“黃芩-槐花”配伍組合對高血壓作用機制的研究筆者尚未見報道，因此，筆者在本研究探討其對高血壓作用的潛在機制，為臨床應用提供科學依據。

黃芩始載于《神農本草經》，為唇形科多年生草本植物黃芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)的干燥根，其味苦、性寒，具有清熱燥濕、止血安胎、瀉火解毒等功效[1]。黃芩主要含有黃酮及其苷類，如黃芩苷、黃芩素、白楊素等[2]?，F代藥理研究表明，黃芩苷在治療高血壓、減少心臟膠原沉積并改善心臟重構、改善胰島素敏感性等方面有明顯效果[3-5]。白楊素具有降壓、改善心肌損傷、糖尿病腎病[6-8]等作用。黃芩素可通過抗氧化應激、抑制蛋白激酶C (protein kinase C，PKC)及多元醇通路的激活、抑制炎癥遞質、降壓、降脂等途徑拮抗高血糖所導致的代謝紊亂，起到腎臟保護作用[9]。槐花出自《日華子本草》，為豆科植物槐(SophoraJaponicaL.)的干燥花蕾及花[10]，其味苦，性微寒，能清肝瀉火，涼血止血。山奈酚、蘆丁、異鼠李素、槲皮素等是槐花的主要有效成分[11]。研究表明，山奈酚具有調節脂質改善肥胖、抗凝血、抗癌等功效[12-14]。蘆丁具有抗病毒、抗氧化和抗炎等作用[15-16]。異鼠李素不僅有抗炎作用[17]，還可以通過抑制生長轉化因子(transforming growth factor，TGF)-β信號通路改善肝纖維化和降低氧化應激水平[18]。在“黃芩-槐花”藥對配伍應用中，槐花以涼血為主，黃芩以瀉火為要，二者配伍，可使苦寒瀉熱、涼血降壓的力量增強，臨床上適用于肝火亢盛的高血壓患者。本研究將采用網絡藥理學和分子對接技術揭示“黃芩-槐花”藥對治療高血壓的具體作用機制。

1 材料與方法

1.1材料 數據來源于中藥系統藥理學分析平臺(TCMSP)(http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)；UniProt蛋白數據庫(https：//www.uniprot.org/)；治療靶點數據庫(therapeutic target database，TTD)(http：//bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/)；OMIM數據庫(http：//www.omim.org/)；CTD數據庫(http：//ctdbase.org/)；Genecards數據庫(https：//www.genecards.org/)；VENNY2.1(http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html )在線工具；Metescape(http：//metascape.org/gp/index.html#/main/step1)；RSCB PBD數據庫 (http：//www.rcsb.org/) ；Sybyl 7.3 軟件；Cytoscape3.6.0軟件。

1.2方法

1.2.1“黃芩-槐花”候選化合物篩選與作用靶點分析 在TCMSP中檢索“黃芩”“槐花”的化學成分，進行口服生物利用度(oral bioavailability，OB) 和類藥性(drug likeness，DL) 分析( TCMSP 網站標準：OB≥30%且DL≥0.18) 收集篩選“黃芩”“槐花”候選化合物，并檢索及其相關靶點，在UniProt數據庫中得到對應的官方名稱，使用Cytoscape軟件建立藥物的“活性成分-作用靶點”網絡模型[19-20]。

1.2.2高血壓相關靶點預測 從TTD、OMIM、CTD和Genecards數據庫檢索高血壓疾病靶點，通過UniProt數據庫得到對應的官方名稱。利用VENNY2.1在線工具將“黃芩-槐花”和高血壓矯正后的靶點基因取交集。

1.2.3“黃芩-槐花”治療高血壓的化合物-靶點網絡的構建 查找交集靶點基因在“黃芩-槐花”中對應的候選化合物，使用Cytoscape軟件構建藥對治療高血壓的“活性成分-作用靶點”網絡模型，并通過Network analyze插件篩選節點較多的關鍵化合物和作用靶點。

1.2.4作用靶點蛋白功能歸屬和通路注釋分析 利用Metescape平臺對交集基因進行作用靶點蛋白功能歸屬，探討“黃芩-槐花”參與調節高血壓的物質類型。同時在平臺上將輸入物種和分析物種均設置為“H.sapiens”，設置P<0.01，對作用靶點進行GO注釋分析及KEGG通路分析。

1.2.5分子對接 選取“黃芩-槐花”治療高血壓的“活性成分-作用靶點”網絡中度值≥5的化合物，與高血壓相關靶點進行分子對接?；衔镉肧ybyl 7.3[21]中sketch模塊構建，添加Gasterger-Huckel 電荷，加氫后用Tripos力場優化，得到最低能量構象，收斂標準為0.004 kJ/( mol·A)。從PDB庫中下載高血壓靶點蛋白的晶體結構，登錄號：3NOS，1UZF。采用Sybyl 7.3中的Surflex-Dock程序進行分子對接。本研究中選取與原配體對比后，結合作用較好的有代表性的化合物進行分析。

1.2.6動物實驗 異鼠李素(isorhamnetin，ISO)和蘇薺黃酮(moslosooflavone，MOS)均購于成都克洛瑪生物科技有限公司；卡托普利(captopril，CAP)購于廣東彼迪藥業有限公司，批號：H44021595。16周齡雄性自發性高血壓大鼠(spontaneously hyertensive rat，SHR)24只和雄性無特定病原體(SPF)級京都種大鼠(wistar-kyoto rat，WKY)6只，均購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物生產許可證號：SCXK(京)2016-0006，實驗動物合格證號：20160167。采用隨機數字分法，將SHR大鼠分為4組，包括高血壓模型組(SHR)、異鼠李素組(ISO組，150 mg·kg-1·d-1)、蘇薺黃酮組(MOS組，150 mg·kg-1·d-1)及卡托普利組(CAP組，13.5 mg·kg-1·d-1)，另設正常血壓對照組(WKY組)，連續給藥6周。

1.2.7大鼠血壓檢測 使用無創血壓測量分析系統儀(型號：ALC-NIBP)，每周檢測各組大鼠尾動脈收縮壓和舒張壓，取其連續3次平均值作為其平均血壓值。

1.2.8大鼠血清中血管內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)和血管緊張素轉化酶(angiotensin converting enzyme，ACE)的檢測 各組大鼠給藥6周后，尾靜脈取血，收集血清，用大鼠eNOS 酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(北京華夏遠洋科技有限公司，批號：CSB-E08323r)檢測eNOS；ACE的ELISA試劑盒(北京華夏遠洋科技有限公司，批號：CSB-E04490r)檢測ACE。

1.2.9蛋白免疫印跡法檢測大鼠內皮中eNOS蛋白水平的表達 用組織勻漿機和超聲破碎儀將血管內皮組織研磨至均質液體，4 ℃，12 000×g離心30 min，取上清液，并用BCA 試劑盒測定蛋白含量。每孔上樣量為40 μg，12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)凝膠電泳分離，電轉2 h至孔徑0.45 μm聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF) 膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，eNOS(武漢博士德公司，批號：EK0697)一抗4 ℃孵育過夜，1×TBST 洗膜4 次后，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗孵育1 h，洗膜4 次后，FluorChem R 多功能成像分析系統進行顯影，用Image J 軟件進行圖像分析。

2 結果

2.1“黃芩-槐花”藥對的活性成分 通過OB≥30，DL≥0.18的標準篩選后，“黃芩-槐花”中有41個化合物具有較好的OB和DL，將其作為候選化合物，結果見表1。在黃芩活性成分中，OB最高為黃芩新素(neobaicalein，OB=104.34%)，DL最高為黃連堿(coptisine，DL=0.86)，大多數黃酮類化合物均有較高OB值和DL值，如降穿心蓮黃酮(panicolin，OB=76.26%，DL=0.29)，黃芩總黃酮Ⅱ(skullcapflavoneⅡ，OB=69.51%，DL=0.44)，蘇薺黃酮(moslosooflavone，OB=44.09%，DL=0.25)等，目前廣泛應用于臨床，可用于治療心血管及代謝性疾病。符合篩選條件的槐花化合物中，OB最高為異鼠李素(isorhamnetin，OB=49.6，DL=0.31)，DL較高為N-[6-(9-acridinylamino)hexyl]benzamide(DL=0.78)此外，山奈酚(kaempferol)具有抗腫瘤、抗炎作用[22]，能改善小鼠模型心功能障礙和心肌纖維化[23]。

2.2“候選活性化合物-作用靶點”網絡模型 41個候選活性化合物與作用靶點的網絡模型，見圖1。因4個化合物在數據庫中尚無作用靶點(表1)，故構建網絡模型中包含264個節點(37個化合物和227個潛在靶點)和766條邊。在網絡中，紅色節點代表分子，藍色節點代表靶點，節點大小代表度值(degree)的大小，每個節點的度值表示網絡中和節點相連的邊的條數。如每一個紅點的度值代表候選化合物所擁有的靶點數目；而每一個藍點的度值則代表著相應靶點所對應的相關化合物數目。圖1中，分子0098(槲皮素，quercetin)的作用靶點最多(degree=154)，接著是0422(山奈酚，kaempferol)(degree=63)，0173(漢黃芩素，wogonin)(degree=44)等，這些化合物具有較多的作用靶點，可能在該藥對的藥理功能中起到較為核心的作用。在作用靶點方面，前列腺素G /H 合成酶2(prostaglandin G/H synthase 2，PTGS2，degree=31)，前列腺素G /H 合成酶1(prostaglandin G/H synthase 1，PTGS1，degree=28)，熱休克蛋白(heat shock protein HSP 90，HSP90，degree=28)，有較多的化合物配體。在227個潛在靶點中，至少有111個靶點與2個或以上的化合物相連，根據表1的度值，在網絡模型中，至少有33個化合物都與≥3個作用靶點相連接，說明“黃芩-槐花”具有多成分、多靶點的復雜性。

圖1 候選化合物與靶點相互作用網絡圖

表1 通過OB和DL預測的41個候選化合物

2.3“黃芩-槐花”作用靶點蛋白的功能歸屬及化合物-靶點網絡的構建 從4個數據庫中收集高血壓相關基因與“黃芩-槐花”的作用靶點取交集后共得到45個靶點，包括一氧化氮合酶3、血栓調節蛋白、腎上腺素受體β2等。表2為Metascape數據庫中45個靶點對應的蛋白功能，表明轉錄因子、受體、酶、離子通道等物質參與“黃芩-槐花”治療高血壓的過程。交集靶點對應的化合物信息見表3，其度值(degree)代表化合物所對應的高血壓靶點的數目。“黃芩-槐花”治療高血壓的相關化合物及靶點網絡模型見圖2，構建網絡模型中包含71個節點(26個化合物和45個潛在靶點)和142條邊。在網絡中，紅色菱形節點代表靶點，綠色三角形節點代表化合物。

圖2 “黃芩-槐花”治療高血壓的活性成分-靶點網絡圖

表2 45個高血壓靶點的蛋白功能

續表2 45個高血壓靶點的蛋白功能

表3 45個高血壓靶點對應的26個化合物

2.4基因功能和通路富集分析 GO注釋分析可描述基因生物學功能，由分子功能(molecular function，MF)、生物過程(biological process，BP) 和細胞組成(cellular component，CC) 三個部分組成。其中，分子功能分析(圖3A) 主要是蛋白磷酸酶結合、腎上腺素能受體活性、蛋白質異源二聚反應活性、細胞因子受體結合等幾個靠前；生物過程(圖3B) 中排名靠前的有：循環系統中的血管過程、活性氧代謝過程、細胞因子介導的信號通路、細胞對有機含氮化合物的反應等；而在細胞組成 (圖3C) 分析中靠前的主要是細胞膜、細胞外基質、質膜外側、軸突、肌膜等。

KEGG pathway 富集分析發現45個靶點涉及17條通路(圖3D)，包括糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路、缺氧誘導因子-1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)信號通路、鈣信號通路、Apelin信號通路、肥厚型心肌病等。

A.分子功能；B.生物過程；C.細胞組成；D.KEGG通路。

2.5分子對接 結果表明異鼠李素作用于eNOS靶點；蘇薺黃酮作用于ACE靶點；分子間的相互作用見圖4，綠色條帶為蛋白質，黃色虛線為氫鍵作用。其中異鼠李素與eNOS原配體的結合方式最相似，一方面與活性口袋中的ARG365以及ALA446形成氫鍵，另一方面，與eNOS形成π-π堆積作用，表明異鼠李素與eNOS的結合作用較好。 蘇薺黃酮與ACE的活性口袋中的HIS513、TYR520、GLN281均形成氫鍵，和卡托普利結合ACE的方式相似。

2.6體內實驗 結果見圖5。與正常對照組比較，SHR組大鼠收縮壓和舒張壓均顯著升高 (P<0.01)，而ISO和MOS治療后均能降低大鼠的收縮壓和舒張壓 (P<0.01)，提示ISO和MOS均有一定的降壓作用。

A.異鼠李素的化學結構；B.蘇薺黃酮的化學結構；C.異鼠李素與eNOS的結合位點；D.蘇薺黃酮與ACE 的結合位點。

ELISA結果顯示，SHR組大鼠血清及內皮中的eNOS水平顯著低于WKY組，而ACE水平高于WKY組(圖5C-5F)，治療后發現，ISO能有效升高eNOS的水平(P<0.01)，MOS則明顯降低ACE的水平(P<0.01)。

3 討論

中藥治療原發性高血壓具有一定優勢，在一定程度上能起到補充治療的作用[24]。本研究利用網絡藥理學首次構建 “黃芩-槐花”藥對治療高血壓的“化合物-靶點”網絡圖，網絡包含71個節點，142條邊，體現成分和靶點之間的復雜作用。

GO分析發現黃芩、槐花治療高血壓主要生物過程涉及循環系統中的血管過程、活性氧代謝過程、細胞因子介導的信號通路等方面。分子功能涉及蛋白磷酸酶結合、腎上腺素能受體活性、蛋白質異源二聚反應活性、細胞因子受體結合等方面。細胞組成涉及細胞膜、細胞外基質、軸突、肌膜等方面。

KEGG通路富集結果表明，藥對治療高血壓的作用機制與包括HIF-1信號通路、鈣信號通路、Apelin信號通路在內的17條信號通路相關，與現有研究結果報道一致：HIF-1的持續升高會損傷血管內皮，引起血管生成障礙及影響血管壁完整性，導致血壓升高；作為第二信使的細胞內鈣離子，能調控細胞的生存和凋亡，同時調節機體的生理病理過程。鈣離子拮抗劑(calcium channel blockers，CCB)也是臨床常用的降壓藥物，CCB可通過阻斷L型鈣通道降低血管阻力，減少血壓的變異性[25]；Apelin可刺激一氧化氮(nitric oxide，NO)的生成，從而舒張血管，降低血壓。上述結果提示，“黃芩-槐花”藥對通過多途徑在高血壓病理發展過程中起調節作用。

①與WKY組比較，P<0.01；②與SHR組比較，P<0.01；③與SHR組比較，P<0.05。

進一步對17條信號通路分析后，筆者選取與多條通路有相互作用的重要基因—人血管內皮型一氧化氮合酶(PDB ID：3NOS)作為分子對接的靶點蛋白，以晶體結構中自帶配體為陽性對照，進行分子對接實驗。同時選取臨床一線降壓藥物血管緊張素轉化酶抑制劑的作用靶點，即血管緊張素轉化酶(PDB ID：1UZF)作為分子對接的第二個候選靶點，分析篩選藥對中作用于這兩個靶點的活性成分。結果表明，槐花中的異鼠李素與eNOS靶點作用力強，黃芩中蘇薺黃酮與ACE靶點結合性好，提示二者可能起協同作用。它們可通過氫鍵、π-π堆積、疏水作用等與靶點蛋白結合，在一定程度上揭示了藥對的分子作用機制。

動物體內實驗驗證表明，異鼠李素和蘇薺黃酮均能降低自發性高血壓大鼠的血壓，且異鼠李素可增加大鼠血清及內皮中的eNOS表達，蘇薺黃酮可降低血清ACE水平，與分子對接靶點預測結果相符。

綜上所述，本研究應用網絡藥理學方法、分子對接、信號通路富集等多種方法對“黃芩-槐花”藥對的化學成分、作用靶點和治療高血壓的作用機制進行探索性研究，并利用動物體內實驗進行初步驗證。本研究符合轉化醫學的宗旨，從臨床工作中發現并提出問題，旨在闡明“黃芩-槐花”藥對治療高血壓的物質基礎和分子機制，為其臨床應用提供科學的實驗依據和數據支持。

此外，異鼠李素和蘇薺黃酮只是“黃芩-槐花”中眾多成分之一，其體內實驗結果表明二者能明顯作用于降壓靶點，首次在一定程度上說明其均為“黃芩-槐花”藥對中的物質基礎，但由于中藥成分復雜，仍需要對“黃芩-槐花”多種單體進行藥效學研究及機制探索。同時，本實驗未考慮藥物在煎煮過程中可能發生的化學反應及藥物成分的變化，將在下一步實驗中進行中藥血清藥物化學的研究，以期解決藥物成分變化的問題，為“黃芩-槐花”的臨床應用及安全性分析提供數據參考。