平肝止復方免煎顆粒聯(lián)合卡馬西平對難治性癲大鼠海馬組織自噬及凋亡的影響*

王強，薛紅，郭磊磊，婁金波，李若照，劉運權

(貴州中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院，貴陽 550000)

癲是一種常見的神經系統(tǒng)慢性疾病，是由大腦神經元突發(fā)性異常放電而對大腦神經功能造成障礙，嚴重影響患者的健康和生活質量[1]。目前已經有大量研究證實，卡馬西平、苯妥英鈉、苯巴比妥等臨床常用抗癲藥物對25%～30%癲患者治療效果不佳[2-4]。因此，尋找針對此類難治性癲患者新的治療方法和有效的干預藥物，具有重要的現(xiàn)實意義。平肝止復方是本研究團隊通過總結臨床經驗及結合前期實驗研究的復方藥。近年來，筆者用平肝止復方免煎顆粒聯(lián)合卡馬西平治療臨床確診的難治性癲患者取得一定的療效[5]，但其對難治性癲的治療機制尚不明確。筆者在本研究旨在探討平肝止復方聯(lián)合卡馬西平對難治性癲大鼠海馬神經元的凋亡及自噬的作用。

1 材料與方法

1.1實驗藥物 平肝止復方免煎顆粒組成：天麻20 g(批號：1008072)，石菖蒲10 g(批號：1009044)，全蝎6 g(批號：1108023)，膽南星10 g(批號：1002036)，郁金12 g(批號：1009018)，均來自四川省新綠色藥業(yè)科技發(fā)展股份有限公司，購于貴州中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院中藥免煎顆粒沖劑配方。取全方藥物58 g，于200 mL純化水溶解后濃縮為0.48 g·mL-1藥液，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2動物 無特定病原體(SPF)級雄性Wistar大鼠44只，體質量200～220 g，購自成都達碩實驗動物有限公司，實驗動物生產許可證號：SCXK(川)2015-30。大鼠于室溫21～25 ℃、相對濕度40%～65%條件下飼養(yǎng)。

1.3試劑 蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒、尼氏染色液、BCA蛋白濃度檢測試劑盒(批號：G1120、G1436、PC0020)均購自北京索萊寶生物公司；TUNEL檢測試劑盒(貨號：C1090)購自上海碧云天生物公司；蛋白Marker(貨號：DM131-02)購自北京全式金生物技術有限公司；兔抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)、B淋巴細胞瘤-2(b-cell lymphoma-2，Bcl-2)、Bcl-2相關X蛋白(bcl 2 associated X protein，Bax)、半胱氨酸蛋白酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase-3，Caspase-3)、自噬效應蛋白(Beclin1)、微管相關蛋白1親鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)一抗及辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標記羊抗兔二抗(批號：ab181602、ab196495、ab32503、ab13847、ab207612、ab192890、ab6721)均購自美國Abcam公司；海人酸(批號：K0250)購自德國Sigma公司；卡馬西平，苯妥英鈉(批號：S45626、S49327)均購自上海源葉生物公司。

1.4儀器 離心機(5427R)購自德國Eppendorf公司；透射電鏡(Tecnai F30)購自美國FEI公司；顱腦定位儀(68526)購自天津市醫(yī)療器械研究所；石蠟切片機(RM2235)購自德國Lecia公司；光學顯微鏡(E200)購自日本尼康公司；超低溫冰箱(DW-86L388J)購自中國海爾公司；微量移液器(3111)購自德國Eppendorf公司；電子天平(CPA26P)購自北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司(感量：0.1 mg)。

1.5動物造模和分組 大鼠適應性飼養(yǎng)7 d后開始造模[6-7]。隨機選取36只大鼠麻醉后，通過腦立體定位儀于右側海馬腹后部CA3區(qū)注射1 μg·mL-1海人酸2 μL，注射完畢留置5 min后緩慢拔出注射器，注射口以鐘表螺絲封口，于對應左側顱骨定位處以牙鉆鉆孔并以鐘表螺絲封住，兩側均用牙科水泥封口，將記錄電極接在鐘表螺絲上面，最后縫合頭皮。假手術組大鼠于同樣解剖定位下予0.9%氯化鈉溶液2 μL，術后對大鼠行為學進行觀察并記錄。采用Racine評分法進行分級評分：I級，咀嚼、眨眼、立須等面部肌肉的抽搐；II級，以點頭運動為主的頸部肌肉抽搐；Ⅲ級，單側前肢陣攣、抽搐；Ⅳ級，雙側前肢陣攣、抽搐伴身體立起；V級，雙側后肢強直，身體背曲強直，跌倒伴全身陣攣。造模后出現(xiàn)Ⅳ級以上發(fā)作視為癲造模成功，未達到Ⅳ級發(fā)作歸入造模不成功組棄用。待癲模型成功后，將癲大鼠以0.03 g·kg-1·d-1苯妥英鈉灌胃；假手術組大鼠灌胃同體積0.9%氯化鈉溶液。連續(xù)灌胃14 d后，進行行為學觀察，仍有25只性發(fā)作，歸為成功的難治性癲動物模型，模型成率69.4%。最后采用隨機分組法進行分組，選取制備成功24只模型大鼠，分為模型對照組、卡馬西平(0.03 g·kg-1·d-1)組，平肝止復方(4.8 g·kg-1·d-1)聯(lián)合卡馬西平(0.03 g·kg-1·d-1)組，每組8只大鼠，另加假手術組8只。造模結束后各組大鼠灌胃相應藥物或0.9%氯化鈉溶液，給藥量通過人和大鼠體表面積比值換算，每天給藥1次，給藥體積10 mL·kg-1，分別給藥28 d后處死大鼠，取海馬組織。

1.6HE染色觀察海馬組織 取大鼠海馬組織，于4%多聚甲醛中固定48 h，經過逐步脫水，石蠟包埋后，以厚度5 μm切片，脫蠟后蘇木精染色，1%鹽酸乙醇分化，伊紅染色，中性樹膠封片，攝像觀察。

1.7尼氏染色觀察海馬組織 取大鼠海馬組織，4%多聚甲醛固定48 h，經過逐步脫水，石蠟包埋后，以厚度5 μm均勻切片，脫蠟后1%甲苯胺藍染色，95%乙醇快速分化，脫色，無水乙醇快速脫水，二甲苯透明，攝像觀察。

1.8透射電鏡觀察海馬組織自噬 取大鼠海馬組織，于2.5%戊二醛和1%鋨酸固定，乙醇和丙酮梯度脫水，環(huán)氧樹脂浸透包埋，制備超薄切片，醋酸鈾和檸檬酸鉛分別染色5 min，透射電鏡觀察攝像觀察。

1.9TUNEL檢測海馬組織凋亡 末次給藥結束后，取海馬組織于4%多聚甲醛中固定48 h，石蠟包埋獲取組織切片，脫蠟，加蛋白酶K工作液孵育20 min，石蠟切片加入TUNEL反應液室溫避光孵育60 min，加DAPI染核，封片，熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

1.10Western blotting檢測海馬組織bcl-2、Bax、Caspase-3、Beclin1、LC3蛋白表達 將海馬組織勻漿后加入蛋白裂解溶液于冰上裂解15 min，4 ℃下，14 000 r·min-1(有效半徑8.5 cm)離心10 min，收集上清液。BCA法測定相應蛋白濃度。取等量蛋白樣品以12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)電泳分離，聚偏氟乙烯(Polyvinylidene fluoride，PVDF)轉膜，5%脫脂奶粉緩沖液于室溫下封閉2 h，經bcl-2、Bax、Caspase-3、Beclin1、LC3、GAPDH等一抗于4 ℃靜置孵育過夜，再以相應HRP標記的二抗37 ℃搖床孵育2 h，電致化學發(fā)光(electrochemiluminescence，ECL)顯影后掃描膠片，統(tǒng)計分析目的蛋白和內參蛋白條帶光密度值，以目的蛋白與內參蛋白光密度比值作為目的蛋白的表達量。

2 結果

2.1大鼠海馬組織病理變化 HE染色結果表明，假手術組大鼠海馬組織結構清晰完整，神經細胞形態(tài)完整，呈圓形、橢圓形，排列有序，核仁清晰，形態(tài)正常。與假手術組比較，模型對照組大鼠神經元細胞排列紊亂，細胞間距增加，神經細胞結構不完整，細胞腫脹、破裂，輪廓模糊；與模型對照組比較，卡馬西平組神經元排列尚且整齊，細胞核形態(tài)較為正常，存在部分破裂、壞死性神經元細胞；與卡馬西平組比較，平肝止復方聯(lián)合卡馬西平組細胞排列較整齊，細胞核形態(tài)較正常，僅有散在的壞輪廓模糊的神經元。結果見圖1。

2.2各組大鼠尼氏體變化 尼氏染色結果顯示，與假手術組比較，模型對照組尼氏體減少，細胞排列紊亂，形狀不規(guī)則。與模型對照組比較，卡馬西平組尼氏體數(shù)量增加，細胞排列較為整齊。與卡馬西平組比較，平肝止復方聯(lián)合卡馬西平組的尼氏體數(shù)量相對增加，細胞排列緊密有序。結果見圖2。

2.3各組大鼠自噬 假手術組大鼠細胞質中線粒體、內質網等結構清晰，未見明顯自噬體；模型對照組可見細胞核固縮、碎裂、胞膜輪廓不清、胞質疏松，與假手術組比較自噬體顯著增加(F=6.476，P<0.05)；卡馬西平組細胞形態(tài)結構基本正常，可見細胞質中線粒體、內質網，與模型對照組比較自噬體顯著減少(F=0.682，P<0.05)；與卡馬西平組比較，平肝止復方聯(lián)合卡馬西平組自噬體顯著減少(F=1.597，P<0.05)，結果見圖3。

2.4大鼠海馬組織及海馬神經元凋亡變化 大鼠海馬組織凋亡情況見圖4。與假手術組比較，模型對照組大鼠海馬組織凋亡增加；與模型對照組比較，卡馬西平組及平肝止復方聯(lián)合卡馬西平組大鼠海馬組織凋亡下降；與卡馬西平組比較，平肝止復方聯(lián)合卡馬西平組大鼠海馬組織凋亡下降。

A.假手術組；B.模型對照組；C.卡馬西平組；D.平肝止復方聯(lián)合卡馬西平組。

A.假手術組；B.模型對照組；C.卡馬西平組；D.平肝止復方聯(lián)合卡馬西平組。

A.假手術組；B.模型對照組；C.卡馬西平組；D.平肝止復方聯(lián)合卡馬西平組；①與假手術組比較，P<0.05；②與模型對照組比較，P<0.05；③與卡馬西平組比較，P<0.05。

2.5大鼠海馬組織Bax、Bcl-2、Caspase-3、Beclin1及LC3表達結果 Western blotting檢測結果見圖5。與假手術組比較，模型對照組大鼠海馬組織Bax、Caspase-3、Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達顯著性增加(F=5.166，5.065，1.388，3.216，P<0.05)，Bcl-2蛋白表達顯著性減少(F=0.233，P<0.05)；與模型對照組比較，卡馬西平組大鼠海馬組織LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達減少(F=0.252，P<0.05)，Bcl-2蛋白表達顯著性增加(F=0.004，P<0.05)，Bax、Caspase-3、Beclin1蛋白表達減少但不顯著(F=1.352，0.259，0.143，P>0.05)，平肝止復方聯(lián)合卡馬西平組大鼠海馬組織Bax、Caspase-3、Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達顯著性減少(F=2.001，0.079，0.628，0.765，P<0.05)，Bcl-2蛋白表達顯著性增加(F=0.349，P<0.05)；與卡馬西平組比較，平肝止復方聯(lián)合卡馬西平組大鼠海馬組織Bax蛋白表達顯著減少(F=0.004，P<0.05)，Bcl-2蛋白表達增加(F=0.291，P<0.05)，Caspase-3、Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達減少但不顯著(F=0.089，0.234，0.162，P>0.05)。

3 討論

癲是神經系統(tǒng)常見的慢性病之一，目前我國癲發(fā)病率約0.5%，其中25%～30%患者通過臨床常見抗癲藥物系統(tǒng)治療后仍得不到有效控制[8-9]。因此，探索難治性癲的發(fā)病機制，改善患者預后，尋找針對此類患者新的治療方法和有效的干預藥物，具有重要的現(xiàn)實意義。平肝止顆粒以天麻為君藥，全蝎、膽南星、郁金為臣藥，石菖蒲為佐使藥。天麻熄風止痙、平驚定。尼氏體是神經細胞的特殊組成部分，能合成細胞器所需的重要蛋白質和產生遞質有關的酶。當神經元細胞出現(xiàn)凋亡、炎性改變等病理變化時，尼氏小體的數(shù)量也會隨之減少、甚至出現(xiàn)降解或消亡。隨著疾病漸愈，尼氏體數(shù)量形態(tài)又恢復正常[10]。研究表明，難治性癲大鼠海馬組織中細胞排列紊亂，細胞腫脹、破裂，尼氏體減少[11-12]。本研究采用較成熟的海人酸及苯妥英鈉誘導法建立難治性癲大鼠模型[6-7]。結果顯示，與難治性癲大鼠比較，平肝止復方聯(lián)合卡馬西平組大鼠海馬神經元細胞尼氏體增加，細胞排列較整齊，細胞核形態(tài)較正常，僅有散在的輪廓模糊的神經元細胞，說明平肝止復方聯(lián)合卡馬西平對難治性癲大鼠海馬神經元具有保護作用。

A.假手術組；B.模型對照組；C.卡馬西平組；D.平肝止復方聯(lián)合卡馬西平組；①與假手術組比較，P<0.05；②與模型對照組比較，P<0.05；③與卡馬西平組比較，P<0.05。

研究表明，Bcl-2及Bax在細胞凋亡進程中發(fā)揮了重要作用。Bax位于細胞質中，當細胞受到凋亡信號刺激，其由細胞質轉位到線粒體膜上，進而導致線粒體跨膜電位下降，改變線粒體膜通透性進而使凋亡因子如Caspase-3釋放增多[13]。Bcl-2是位于線粒體上的一種跨膜蛋白，能夠與Bax結合形成二聚體，可穩(wěn)定線粒體膜電位，抑制促凋亡因子釋放從而起抗凋亡作用[14]。近年來，研究表明癲的發(fā)生過程中，海馬組織Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表達異常，神經元細胞凋亡嚴重[15-17]。本研究表明，相對于模型對照組，平肝止復方聯(lián)合卡馬西平組大鼠海馬組織Bax、Caspase-3蛋白表達減少，Bcl-2蛋白增加，細胞凋亡明顯降低，說明平肝止復方聯(lián)合卡馬西平可抑制海馬神經元凋亡，從而保護海馬神經元。

自噬即細胞的自我消化，是細胞把待降解的物質通過自噬體轉運到溶酶體，在溶酶體的酸性環(huán)境以及溶酶體酶作用下使待降解產物被降解的過程[18]。正常生理條件下，自噬處于低水平，機體通過自噬降解細胞內多余、衰老或受損的蛋白及細胞器，來維持細胞內環(huán)境穩(wěn)態(tài)[19]。當細胞受到饑餓、低氧和高溫等影響時，自噬被激活，機體通過自噬降解胞內大分子及細胞器為細胞提供能量，促進細胞存活。另外自噬也是一把雙刃劍，當細胞中自噬被過度激活后則引發(fā)細胞自噬性死亡[20]。Beclin1是哺乳動物中最早發(fā)現(xiàn)的自噬基因，其表達水平一定程度上反映自噬的活性[21]。LC3是自噬標志性蛋白，分為2個亞型，在細胞自噬形成過程中LC3Ⅰ被剪形成LC3Ⅱ，LC3Ⅱ定位于自噬體膜上是自噬的標志性分子。因此，在細胞自噬進程中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值可以反映自噬被激活的程度[22-23]。本研究結果顯示，模型對照組大鼠海馬組織中自噬體增加，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及Beclin1蛋白含量也增多，說明難治性癲大鼠海馬組織中自噬過度激活。平肝止復方聯(lián)合卡馬西平組大鼠海馬組織中自噬體減少，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及Beclin1蛋白含量也降低，說明平肝止復方聯(lián)合卡馬西平可糾正海馬組織異常自噬。與本研究類似，其他研究也表明癲大鼠海馬組織自噬異常激活，抑制大鼠海馬組織的過度自噬可以保護海馬神經元從而減輕癲癥狀[24-25]。

綜上所述，平肝止復方聯(lián)合卡馬西對難治性癲大鼠神經元有保護作用，其具體機制可能與調節(jié)神經元細胞自噬及凋亡有關，但難治性癲的發(fā)生機制較為復雜，是否還存在其他影響因素有待進一步深入研究。

A.假手術組；B.模型對照組；C.卡馬西平組；D.平肝止復方聯(lián)合卡馬西平組；①與假手術組比較，P<0.05；②與模型對照組比較，P<0.05；③與卡馬西平組比較，P<0.05。