基于網絡藥理學的冠心舒通膠囊藥效物質與作用機制研究*

時暢，孫冠男，王丹，王晗，顏久興

(1.天津醫科大學藥學院，天津 300070；2.天津生物工程職業技術學院，天津 300462；3.天津醫科大學總醫院，天津 300070；4.天津中醫藥大學第一附屬醫院藥學部，天津 300193)

冠心病是一種常見心血管疾病，已成為許多國家的主要致死原因之一，其危險因素包括高血壓、糖尿病、高膽固醇、吸煙、酗酒和抑郁等[1]。目前治療冠心病的藥物包括硝酸鹽、他汀類藥物、鈣通道阻滯劑和醛固酮受體拮抗劑，而這些藥物會引起嚴重的不良反應，如頭暈頭痛、腎衰竭和心動過緩等[2]。傳統中藥具有對機體進行整體調節且不良反應少的特點，對于需要進行長期藥物治療的冠心病具有獨特的優勢[3]。冠心舒痛膠囊(GXSTC)作為傳統中藥方劑，由五味中藥材組成：廣棗，丹參，丁香，冰片和天竺黃，其中，廣棗為君藥，丹參為臣藥，丁香與冰片為佐藥，天竺黃為使藥，多年來一直用于治療冠心病[4]。然而，其具體作用機制尚不明確。冠心舒通膠囊中包含多種成分，并在體內靶向多重靶點產生治療作用，這使得僅通過常規實驗手段來探索其作用機制過于復雜，并且效率低下。Hopkins最早提出將網絡藥理學作為一種強大的藥物作用機制分析工具，它將藥物作用網絡與生物網絡相結合，并系統地分析網絡中各節點間的相互作用，這與傳統中藥通過多重靶點對病患機體進行整體調節的觀點相一致[5-6]。網絡藥理學為探究抗心血管疾病傳統中藥在分子水平上的多重藥理機制提供新的可能性。

1 材料與方法

1.1冠心舒通膠囊的化合物數據集建立與成分比較 依托中藥系統藥理學數據庫和分析平臺(TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)；中藥綜合數據庫(TCMID，http：//www.megabionet.org/tcmid/)；中醫藥資料庫(http：//tcm.cmu.edu.tw/)和相關文獻，檢索收集冠心舒通膠囊五味藥材中所含的化合物成分，同時獲取每個成分的藥理學性質參數，包括相對分子質量(MW)、氫鍵供體數目(nHDon)、氫鍵受體數目(nHAcc)、脂水分配系數(ALogP)、口服生物利用度(OB)、Caco-2細胞滲透性(Caco-2)和類藥性(DL)，并對各參數進行類比分析。

1.2冠心舒通膠囊的候選化合物篩選 化合物的吸收、分布、代謝和排泄(ADME)性質對于其在體內發揮治療作用至關重要。此部分使用3個與ADME相關的指標，分別為OB、Caco-2和DL，閾值分別設置為：OB≥30%，Caco-2≥-0.4和DL≥0.18[7]。滿足以上3個條件的化合物被篩選為候選化合物，然后將其輸入到化合物數據庫(PubChem Compound，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pccompound)中進行標準化處理并獲取每個化合物的PubChem CID。

1.3冠心舒通膠囊的體內靶點預測與篩選 通過中藥分子機制生物信息學分析工具(BATMAN-TCM，http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)獲取上述候選化合物的體內靶點。BATMAN-TCM是第一個專門用于中藥分子機制研究的在線生物信息學分析平臺[8]。將由PubChem CID代表的候選化合物列表輸入BATMAN-TCM中，參數設置如下：Score cutoff≥20且P<0.05。符合參數要求的靶點被視為候選化合物的候選靶點。隨后將候選靶點輸入到治療靶標數據庫(TTD，http：//bidd.nus.edu.sg/group/cjttd)，PharmGKB數據庫(http：//www.pharmgkb.org)，Uniprot數據庫(https：/ /www.uniprot.org)和Drugbank數據庫(http：//www.drugbank.ca/)中，篩選與冠心病的發生發展有關的靶點為潛在靶點，與之存在相互作用的化合物為潛在活性化合物。

1.4冠心舒通膠囊的網絡建立與分析 為了進一步確定活性成分，體內靶點與作用機制，利用Cytoscape 3.6.1構建冠心舒通膠囊網絡[9]。具體如下：通過連接候選化合物與其對應的候選靶點，建立候選化合物-候選靶點(candidate compound-candidate carget)網絡；將潛在活性化合物與其潛在靶點連接起來，構建與冠心病治療相關的潛在活性化合物-潛在靶點(potential compound-potential target)網絡；連接潛在靶點與從TTD，PharmGKB和Drugbank數據庫獲取的潛在靶點相關疾病，建立潛在靶點-疾病(potential target-disease)網絡。隨后利用網絡分析工具Network Analyzer對網絡中的兩個關鍵拓撲參數“度(degree)”和“介度中心性(betweenness centrality)”進行計算與分析。“度”表示在網絡中與某節點相連接的節點數目，“介度中心性”表示通過某節點的最短路徑的數量，這兩個參數的值越大，則該節點在網絡中越重要[10]。有研究表明，與“介度中心性”比較，使用“度”這一參數更優，并且在網絡藥理學研究中，對“度”的應用也更為廣泛[11-12]。

2 結果

2.1冠心舒通膠囊的化合物數據集建立與成分比較 通過上述數據庫與文獻挖掘，共獲得384種化合物成分及其藥理學性質參數，其中，廣棗包含43種化合物，丹參170種，丁香109種，冰片30種，天竺黃32種。對上述5味藥材所含化合物的藥理學參數進行比較分析，見表1。結果顯示廣棗與丹參這組成分在類藥性等多項藥理學參數接近度較高。見圖1。藥物分子的藥理活性與其化學結構特征密不可分，而類藥性和ADME參數是藥物分子所具有的結構特征和理化性質的綜合體現[13-15]。同時有研究表明廣棗和丹參可通過相似的作用機制產生明確的心血管保護作用，并且常被聯合應用于心血管疾病的治療，這與冠心舒通膠囊中廣棗為君丹參為臣的配伍規則一致[16-20]。因此，筆者判斷廣棗和丹參具有相似的藥理學性質。

表1 冠心舒通膠囊中五味藥材的藥理學性質參數

2.2冠心舒通膠囊的候選化合物篩選 上述384個化合物中，有36個化合物符合設定的參數閾值。有6個化合物雖未達到設定閾值，但已有文獻證明他們具有冠心病治療作用，所以也被歸為候選化合物。這6個化合物分別為鞣花酸(M1)、沒食子酸(M43)、丹參素(M183)、原兒茶酸(M3)、冰片(M333)和異冰片(M325)。綜上所述，共計從冠心舒通膠囊中篩選出42個候選化合物進行下一步研究，相關信息見表2。

表2 冠心舒通膠囊中的42個候選化合物與其藥理學性質參數

2.3冠心舒通膠囊的體內靶點信息 將用PubChem CID表示的42種候選化合物列表輸入到BATMAN-TCM數據庫中，成功獲取到282個不重復候選靶點。利用TTD、 PharmGKB、Uniprot和Drugbank數據庫篩選出了32個與冠心病發生發展相關的潛在靶點，見表3。與這32個潛在靶點存在相互作用的化合物有30個，即為冠心舒通膠囊中的潛在活性化合物。

表3 32個潛在靶點信息

2.4冠心舒通膠囊的候選化合物-候選靶點網絡建立與分析 候選化合物-候選靶點網絡(圖1)中包含324個節點，其中包括42個候選化合物和282個候選靶點。網絡分析表明，>64%候選靶點與≥2種候選化合物存在相互作用。如腫瘤壞死因子-α(TNF-α，T207)可以被脫氧新隱丹參酮(M148)，鐵氨酚(M157)，miltiononeI(M168)和1-hydroxy-2，8，8-trimethyl-6，7-二氫-5H-菲-3，4-二酮(M173)四個候選化合物調節。前列腺素合酶1(PTGS1，T17)，微粒體甘油三酸酯轉移蛋白亞基(MTTP，T3)和維生素K環氧還原酶復合物亞基1(VKORC1，T83)也分別與冠心舒通膠囊中多種成分存在相互作用。這說明冠心舒通膠囊具有多成分、多靶點、協同調節的作用特點。

2.5冠心舒通膠囊的潛在活性化合物-潛在靶點網絡建立與分析 為進一步研究冠心舒通膠囊對冠心病的治療作用機制，構建潛在活性化合物-潛在靶點網絡(圖2)，其包含62個節點(30個潛在活性化合物和32個潛在靶點)。網絡分析結果顯示，超過73.3%潛在活性化合物作用于兩個以上潛在靶點，有16種化合物節點 “度”數值高于均值2.9，這16種化合物可能為冠心舒通膠囊治療冠心病的有效成分，見表4。除此之外，其中12種已被有關文獻報道具有抗炎、抗氧化和抗細胞凋亡等生物活性。這表明冠心舒通膠囊可能通過發揮抗炎、抗氧化以及抗細胞凋亡作用對冠心病產生治療效果。

表4 16種“度”值高于2.9的潛在活性化合物信息

2.6冠心舒通膠囊的潛在靶點-疾病網絡建立與分析 在潛在靶點-疾病網絡中(圖3)，與32個潛在靶點相關的疾病有21種。其中大多數為心血管系統疾病，例如冠心病、高血壓、血栓形成、動脈粥樣硬化和高脂血病等。除此之外，阿爾茨海默癥作為一種神經退行性疾病，也在網絡中處于關鍵地位。這表明除冠心病外，冠心舒通膠囊還可用于治療阿爾茨海默病等多種疾病，為冠心舒通膠囊的其他可能臨床用途提供了新的方向。

3 討論

本研究采用網絡藥理學方法，篩選出冠心舒通膠囊中的有效成分與作用靶點，并構建化合物-靶點、靶點-疾病網絡。通過進行網絡拓撲參數分析，發現16種化合物的“度”數值高于平均水平，其中12種已被證實具有抗炎、抗氧化和抗細胞凋亡活性。例如，槲皮素(M42)具有很強的抗脂質過氧化活性，同時可以通過減少一氧化氮、誘導型一氧化氮合酶和白細胞介素(IL)-6的產生而發揮抗炎作用[21-22]。豆甾醇(M292)可以阻斷NF-κB通路以抑制基質金屬蛋白酶(MMP)的表達以及促炎遞質前列腺素E2(PGE2)的釋放，發揮抗炎作用[23]。積雪草酸(M342)通過抑制線粒體依賴性細胞凋亡和阻斷TNF-α介導的凋亡來減輕心肌細胞的損傷，同時還可減少IL-1B，IL-6，IL-18和阻斷TNF-α等促炎細胞因子的產生[24]。這表明冠心舒通膠囊對冠心病的治療作用機制可能為抗炎、抗氧化與抗細胞凋亡。網絡分析結果同時表明，拓撲參數值最高的7個靶點為ESR1(T72)，PTGS2(T18)，PTGS1(T17)，VKORC1(T83)，MTTP(T3)，ESR2(T236)，TNF-α(T207)。這7個靶點可能為冠心舒通膠囊治療在體內產生治療作用的關鍵靶點。其中，PTGS2與類花生酸的合成有關，有助于產生促進冠心病發生發展的炎癥環境[25]。TNF-α可以通過增加損傷組織中的炎性細胞，加劇心肌血管平滑肌重塑，同時對心肌產生負性變力作用，從而導致心肌纖維壞死和冠狀動脈缺血[26]。這進一步說明了冠心舒通膠囊是通過多種成分作用于多重靶點，發揮抗炎、抗氧化、抗細胞凋亡作用對冠心病進行治療的。

傳統中醫理論注重調節患者機體的整體功能與狀態，并且不同的疾病可能具有共同的發病根源與癥狀，因此往往可以用同一中藥方劑進行治療。通過分析冠心舒通膠囊的潛在靶點-疾病網絡，發現阿爾茨海默病等除冠心病外的其他疾病也在網絡中占據重要位置。阿爾茨海默病是老年人癡呆的最常見原因，其病理特征是患者大腦中的淀粉樣蛋白-β斑塊沉積與細胞內神經原纖維發生纏結，同時淀粉樣蛋白-β本身為一種較強的促炎因子，會促進腦內慢性炎癥的產生，進而導致神經元凋亡與神經變性[27]。除此之外，有研究表明氧化應激反應也與阿爾茨海默病的進展有關，腦內活性氧含量增加會直接影響神經元突觸的活性和神經遞質的傳遞，從而導致認知功能障礙[28]。冠心舒通膠囊中的廣棗、丹參等成分可通過抑制NF-κB等與炎癥相關的信號通路，改善機體微循環狀態，保護血管內皮發揮其抗炎效應。除此之外，廣棗中酚酸類成分，丹參中的丹參素、丹參酮等成分均具有良好的抗氧化活性[16-18]。并且已有報道證明丹參可通過抑制淀粉樣蛋白-β聚集并減少淀粉樣蛋白-β誘導產生的細胞毒素對阿爾茨海默病發揮治療作用[29]。冠心舒通膠囊對阿爾茨海默病的治療效用再一次印證傳統中藥具有“異病同治”的優勢，并且為挖掘經典方劑的其他臨床治療作用提供了新的思路。

紅色菱形代表候選化合物節點，其大小與節點在網絡中的“度”數值有關。黃色三角形的“度”值為1，藍色圓形為2，綠色V形≥3。

紅色菱形代表潛在活性化合物，綠色圓形代表潛在靶點。其大小分別與它們在網絡中的“度”數值有關。

綠色圓形代表潛在靶點，紫色方形代表與之相關的疾病。其大小分別與它們在網絡中的“度”數值有關。

傳統中藥具有多成分多靶點的特點，能夠從系統層面對機體進行整體調節，作用機制十分復雜，對其的研究方法也應與西藥有所不同。本研究使用網絡藥理學綜合研究策略，發現冠心舒通膠囊中16種活性成分及其體內靶點，揭示冠心舒通膠囊對冠心病的治療作用機制可能為抗炎、抗氧化與抗細胞凋亡。除對冠心病具有良好療效外，網絡分析結果顯示，冠心舒通膠囊還存在治療阿爾茨海默病等多種疾病的藥理作用。但其在體內的具體作用方式仍需進一步探究。