星點設計-效應面法優化梔子苷脂質體制備工藝*

曹娟，侯雪芹，王福剛

[山東第一醫科大學(山東省醫學科學院)藥學院，泰安 271016]

梔子苷是從茜草科植物梔子(GardeniajasminoidesEllis)的成熟果實中提取的活性成分[1]，具有保肝[2]、解熱[3]、抗炎鎮痛[4]、抗氧化[5]及抗腫瘤[6]等藥理作用。研究表明，梔子苷水溶性較強，口服吸收差，所以生物利用度比較低，從而影響其藥效的發揮[7]。將梔子苷制備成脂質體，使其分散于脂質體雙分子層中，可顯著提高其在胃腸道的穩定性，增加生物利用度，增強臨床療效[8]。

脂質體是一種脂質雙分子層組成的內部為水相的球狀囊泡，主要構建原料為磷脂和膽固醇，可分別包裹水溶性和脂溶性藥物于磷脂雙分子層和水相中，載藥范圍廣，可明顯改善藥物的理化性質，能有效提高藥物生物利用度[11]。近年來，星點設計-效應面優化法在制劑工藝篩選中被廣泛應用[9-11]，與常用的正交設計方法相比，其實驗結果準確度高、數學模型預測值與真實值更接近[12]。因此，筆者在單因素實驗基礎上，結合星點設計-效應面法優化梔子苷脂質體的制備工藝，為其制劑學研究和應用提供實驗依據，然后用激光粒度儀對梔子苷脂質體的平均粒徑和多分散指數(PDI)值進行測定；并采用高效液相色譜(HPLC)法對脂質體中梔子苷的含量測定方法進行考察，報道如下。

1 儀器與材料

1.1儀器 SPD-10Avp 型高效液相色譜儀(島津公司)；DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(上海予申儀器有限公司)；Sizer Nano ZS90型激光粒度分析儀 (英國Malvern公司)； AB135-S梅特勒-托利多電子天平(瑞士梅特勒儀器公司，感量：0.01/0.1 mg)；UV-2550紫外分光光度計(日本島津公司)。

1.2材料 梔子苷對照品(天津西瑪科技有限公司，批號：110749-201718)；梔子苷原料藥(質量分數>95%，陜西慈緣生物技術有限公司)；膽固醇(上海源葉生物科技有限公司，批號：S11040)、大豆卵磷脂(上海源葉生物科技有限公司，批號：S30869)；色譜純甲醇和乙腈(美國Fisher 公司)；其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1梔子苷脂質體的制備 采用薄膜分散法制備脂質體。精密稱取磷脂200 mg，膽固醇50 mg，置于250 mL圓底燒瓶中，加入適量三氯甲烷超聲溶解，于50 ℃恒溫水浴條件下減壓蒸發，使其在燒瓶內壁上形成均勻的類脂膜。稱取梔子苷10 mg，加入 pH值6.8的磷酸鹽緩沖溶液30 mL；然后將磷酸鹽溶液加入圓底燒瓶，常壓旋轉水化1 h后，于冰水浴中超聲，即得梔子苷脂質體。

2.2梔子苷含量測定方法的建立

2.2.1色譜條件與系統適應性實驗 色譜柱：Diamonsil plus C18( 4.6 mm × 250 mm，5 μm)；流動相為乙腈-水(15：85)；流速為1.0 mL·min-1；進樣量為20 μL；檢測波長為 238 nm；柱溫為30 ℃。理論板數按梔子苷峰計算>6000，分離度符合規定。

2.2.2梔子苷對照品溶液的配制 精密稱取梔子苷對照品4.01 mg，置于10 mL量瓶中，加入甲醇超聲溶解，并定容至刻度，得到401 μg·mL-1的梔子苷對照品溶液。

2.2.3梔子苷標準曲線的制備 精密吸取梔子苷對照品溶液，用甲醇進行梯度稀釋，得到質量濃度為0.80，1.60，3.20，4.81，8.01 μg·mL-1對照品溶液，HPLC法測定峰面積。以質量濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)，回歸方程為：Y=149 999X-5 876.1，r=0.999 4。結果表明，梔子苷在0.80～8.01 μg·mL-1范圍內，濃度與峰面積呈現良好的線性關系。

2.2.4精密度實驗 分別精密吸取高、中、低濃度梔子苷對照品溶液(8.01，4.81，1.60 μg·mL-1)，分別進樣6 次，進樣20 μL，測定峰面積，計算日內精密度。梔子苷低、中、高3種濃度RSD分別為1.06%，0.47%，0.56%，說明本方法精密度良好。

2.2.5重復性實驗 精密吸取梔子苷脂質體混懸液，用甲醇破乳，稀釋成4.81 μg·mL-1溶液6份，進樣20 μL，測定峰面積，計算脂質體中梔子苷的量，其RSD為0.95%，說明本方法重復性良好。

2.2.6回收率實驗 精密吸取梔子苷脂質體混懸液(用甲醇稀釋成4.81 μg·mL-1)1 mL，分別加入高、中、低濃度梔子苷對照品溶液(8.01，4.81，1.60 μg·mL-1)1 mL，然后加入甲醇破乳超聲，進樣20 μL，測定峰面積(每個濃度3份)。結果高、中、低3種濃度回收率分別為99.84%，99.75%，100.04%，RSD分別為1.25%，0.87%，0.73%(n=3)。

2.2.7穩定性實驗 精密吸取梔子苷脂質體混懸液，用甲醇稀釋成4.81 μg·mL-1溶液，分別于 0，2，4，6，8，10，12 h，進樣20 μL，HPLC法測定峰面積。結果RSD 為1.24%，表明樣品在12 h內穩定性良好。

2.3包封率的測定 精密吸取梔子苷脂質體2 mL，加入10 mL量瓶中，加入甲醇定容，并超聲破乳，用孔徑0.22 μm微孔濾膜濾過，按照“2.2.1”項色譜條件進行測定藥物總量(C總)。精密吸取梔子苷脂質體2 mL，置于透析袋內，于20 mL純水中透析12 h，按照“2.2.1”項下色譜條件進行測定梔子苷含量(C游)。包封率(%)=(1-C游/C總)×100%，C游為游離梔子苷質量濃度，C總為梔子苷中質量濃度。載藥量(%)=Wd/Wp，Wd為脂質體中的藥物質量，Wp為脂質體的總質量。

2.4單因素考察

2.4.1成膜溫度的考察 按“2.1”項條件制備脂質體，設定成膜溫度分別為40，50，60 ℃，磷脂與膽固醇比、脂藥比和水化溶劑用量等不變，并計算包封率。實驗結果表明，按以上溫度制備的梔子苷脂質體包封率分別為75.08%，84.69%，74.16%。根據實驗結果，確定成膜溫度為50 ℃。

2.4.2磷脂與膽固醇比例的考察 按“2.1”項條件制備脂質體，設定磷脂與膽固醇比分別為1：1，4：1，7：1，磷脂與膽固醇比、脂藥比和水化溶劑用量等不變。按以上比例制備的梔子苷脂質體包封率分別為52.84%，80.25%，82.09%。根據實驗結果，說明選用不同的磷脂與膽固醇比例會明顯影響脂質體包封率。

2.4.3脂藥比的考察 按“2.1”項條件制備脂質體，設定脂藥比(磷脂膽固醇之和與梔子苷比)分別為10：1，25：1，40：1，磷脂與膽固醇比、脂藥比和水化溶劑用量等不變。按以上比例制備的梔子苷脂質體包封率分別為52.85%，84.10%，78.64%。根據實驗結果，脂藥比對脂質體包封率的影響較為顯著。

2.4.4水化溶劑用量的考察 按“2.1”項條件制備脂質體，設定水化溶劑用量分別為20，30，40 mL，磷脂與膽固醇比、脂藥比和水化溶劑用量等不變，梔子苷脂質體包封率分別為67.82%，84.10%，80.61%。說明水化溶劑容量對脂質體的包封率影響較為顯著。

2.4.5水化溶劑pH值的考察 按“2.1”項條件制備脂質體，設定水化溶劑的pH值分別為6.5，6.8，7.2，其磷脂與膽固醇比、脂藥比和水化溶劑用量等不變，梔子苷脂質體包封率分別為75.02%，82.10%，81.03%。根據實驗結果，確定水化溶劑的pH值為6.8。

2.5星點設計優化處方和制備工藝

2.5.1星點實驗設計 根據單因素考察的實驗結果，選擇對包封率影響較大的脂藥比、磷脂與膽固醇比、水化溶劑用量作為考察對象，采取三因素、五水平的星點設計-效應面優化法，篩選最佳處方。結合單因素實驗結果確定自變量范圍：脂藥比(A)10：1～40：1、磷脂與膽固醇比(B)1：1～7：1、水化溶劑用量(C)20～40 mL，因素水平見表1。實驗設計表及結果見表2。

表1 星點設計-效應面的因素與水平

表2 星點設計-效應面法優化處方組成

2.5.2模型擬合 根據實驗結果，選用Design-Expert 8.0.6.1版軟件，分別以包封率和載藥量為因變量對各因素進行二次多項式擬合。結果包封率(%)=86.47+2.27A+2.49B+1.44C+1.17AB+0.54AC-0.062BC-2.98A2-2.40B2-2.38C2(P<0.000 1，R2=0.9436)；載藥量(%)=4.21+0.19A+0.27B+0.073C+0.19AB+0.075AC-0.057BC-0.22A2-0.13B2-0.15C2(P=0.000 8，R2=0.895 1)。

對2個模型的回歸參數進行方差分析，結果見表3、表4。對于包封率，模型P<0.000 1，具有極顯著性；A、B、C、A2、B2、C2極顯著，其他項不顯著。對于載藥量，模型P=0.000 8，具有極顯著性差異；A、B、A2極顯著，AB、B2、C2顯著，其他項不顯著。

表3 響應面模型對包封率的方差分析結果

表4 響應面模型對載藥量的方差分析結果

2.5.3效應面分析 選用Design-Expert 8.0.6.1版軟件，依據所擬合的數學模型，分別繪制評價指標對2個考察因素的三維效應面圖，另外一個因素置為中心點值，結果見圖1、圖2。

圖1 各種因素對包封率的響應曲面圖

圖2 各因素對載藥量的響應曲面圖

由圖1、圖2可知，隨著這3個因素的增大，包封率和載藥量均呈先增大后減小的趨勢，包封率和載藥量的影響大小均為磷脂與膽固醇比>脂藥比>水化溶劑用量，水化溶劑用量與磷脂與膽固醇比兩者交互作用對OD值影響不明顯。

2.5.4效應面預測與驗證 根據軟件預測結果，再結合實際實驗數據，選取梔子苷脂質體的最佳處方為：脂藥比32：1、磷脂與膽固醇比6：1和水化溶劑用量32 mL。包封率和載藥量預測值分別為87.45%，4.54%。按上述優選出來的處方條件重復進行3次實驗。結果包封率的平均值為87.8%，RSD為1.8%(n=3)，與預測值相對誤差為1.48%。載藥量平均值為4.48%，RSD為1.6%(n=3)，與預測值相對誤差為1.32%。

2.6梔子苷脂質體的質量評價

2.6.1脂質體的形態 取適量按最佳處方所制備的梔子苷脂質體混懸液，加適當純化水稀釋，滴加在銅網上，用1%磷鎢酸染色2 min，待銅網干燥后，用透射電鏡(TEM)觀察并拍攝照片，結果見圖3。梔子苷脂質體呈乳白色，質地較稀，置于4 ℃環境中24 h，脂質體混懸液穩定。由圖3可知脂質體分布均勻，形態完整，以球形為主。

圖3 梔子苷脂質體TEM圖

2.6.2粒徑及點位的考察 室溫條件下，取適量梔子苷脂質體加入PBS液稀釋，用納米激光粒度儀測定其粒徑分布及Zeta電位。粒徑分布見圖4。結果表明，梔子苷脂質體平均粒徑為157.0 nm，粒徑較小，可以促進吸收；峰形為單峰；多分散系數(PDI)值為0.234，說明脂質體粒徑分布比較均勻；Zeta電位為-28.7 mV，說明脂質體比較穩定。

圖4 梔子苷脂質體粒徑分布

3 討論

本實驗采用薄膜分散法制備脂質體，制備過程中需要注意成膜溫度，若溫度過高，容易導致磷脂變性，過低則容易析出沉淀。溶劑的選擇也非常關鍵，選用甲醇作為溶劑時，對卵磷脂的溶解性差，成膜效果不理想；溶劑為乙醚時，藥物溶解速度較慢。最終選用三氯甲烷為溶劑，藥物溶解較好，成膜較為理想。

本實驗采用薄膜分散法制備梔子苷脂質體，以包封率和載藥量為考察指標，對影響脂質體性能較大的脂藥比、磷脂與膽固醇比例、水化溶劑用量3個指標采用星點設計-效應面法進行優化，模型對于自變量與因變量的擬合效果較好，預測梔子苷脂質體的制備工藝穩定可行。確定最佳制備工藝為：脂藥比32：1，大豆卵磷脂與膽固醇質量比6：1，水化溶劑用量32 mL。所得脂質體粒徑為(157.0±6.4) nm，包封率(87.8±1.68)%，載藥量(4.48±2.58)%。本研究可為梔子苷脂質體的進一步臨床應用奠定良好的基礎。