甲狀腺癌患者microrna-675、LncRNA LUCAT1、Actinin-4、IGF-1R的表達與臨床特征及預后的相關性

孫睦 趙俊英 孫振剛 楊帥 牛萬錦 李俊峰

甲狀腺癌是一種常見內分泌腫瘤，且近年來患病率持續增加[1]。上述這個過程每個步驟均涉及1個或多個基因改變，這個過程>10年。甲狀腺癌與甲狀腺良性結節的臨床表現、療效、生存期具有很大差異，其中細胞遺傳學異常與患者的預后顯著相關[2]。為此找到診斷治療甲狀腺癌的新靶點，尋求更簡單、有效的診療方式，對改善患者預后具有重要價值[3]。MicroRNA(miRNA)是一類單鏈小RNA，在腫瘤的發生發展過程中發揮重要的作用，microrna-675已被發現可參與多種重要生命過程，在前列腺癌、鼻咽癌、食管癌、乳腺癌中呈現異常表達譜情況[4,5]。長鏈非編碼RNAs(LncRNAs，long non-coding RNAs)為不具備編碼蛋白能力的RNA。LncRNAs具有明顯的時空表達特異性，可調控蛋白編碼基因的表達水平[6]。Actinin-4作為actin綁定蛋白，與細胞能動性和腫瘤的入侵、遷移密切相關。人類惡性腫瘤發展過程中，Actinin-4蛋白水平顯著升高，并且與腫瘤的不良預后相關[7],但其與甲狀腺癌的關系鮮有報道。胰島素樣生長因子1(IGF-1)及其受體(IGF-1R)在多種惡性腫瘤發病模型中起重要作用，其中IGF-R1在人甲狀腺癌細胞內也過表達。IGF-1R特異性抑制劑(中和抗體、拮抗肽或激酶抑制劑NVP-ADW742)可以抑制多種腫瘤細胞生長[8]。本文具體探討了甲狀腺癌患者microrna-675、LncRNA LUCAT1、Actinin-4、IGF-1R的表達與臨床特征及預后的相關性，以明確甲狀腺癌的發生機制，為改善患者預后提供參考。報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年1月至2019年3月確診為甲狀腺癌患者78例(甲狀腺癌組)與甲狀腺良性結節患者78例(良性組)。甲狀腺癌組：甲狀腺乳頭狀癌54例，濾泡性癌20例，髓樣癌4例；臨床分期：Ⅰ期35例，Ⅱ期25例，Ⅲ期18例；組織學分化：低分化22例，中高分化56例；發病位置：左側36例，右側42例；遠端轉移36例。良性組：結節性甲狀腺腫60例，甲狀腺腺瘤18例。本研究得到了所有患者的知情同意，也取得了本院倫理委員會的批準書。2組患者資料等比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。見表1。

表1 2組一般資料比較

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準：甲狀腺癌與甲狀腺良性結節都經過病理確診；臨床資料完整；年齡30～70歲；有相對完整的臨床及病理資料；均未進行治療的初診患者。

1.2.2 排除標準：妊娠期及哺乳期女性；患有淋巴瘤等其他惡性腫瘤及嚴重免疫缺陷患者；合并糖尿病患者；臨床資料缺乏者；不配合調查者；合并精神障礙的患者；伴有出血性疾病、出血傾向；精神系統疾病或長期心理壓力過大患者。

1.3 microrna-675、LncRNA LUCAT1表達檢測 采集所有患者的空腹靜脈血3～5 ml，分為2管。其中一管抗凝后室溫放置2 h，取下層全血組織，分離外周血單個核細胞。提取總RNA，采用PrimerScript RT Reagent試劑盒(Takala)將RNA逆轉錄為cDNA，然后采用定量PCR檢測試劑盒(taqman real-time PCR assays，德國Qiagen)檢測microrna-675、LncRNA LUCAT1表達水平。PCR擴增條件：94℃預變性5 min，94℃變性1 min，55℃退火25 s，40個循環，4℃保存。實驗結果采用相對定量法ΔΔCT進行分析，計算2-ΔΔCT，檢測全血microrna-675、LncRNA LUCAT1相對表達水平。

1.4 Actinin-4、IGF-1R表達檢測 取1.2中的另一管血液樣本，不進行抗凝，室溫放置2 h后3 000 r/min離心10 min(離心半徑為10 cm)，分離上層血清在-80℃冰箱保存。采用酶聯免疫法檢測血清Actinin-4、IGF-1R含量，檢測試劑盒都由上海生工公司提供。

1.5 臨床資料與預后調查 調查所有患者的一般資料，詳細調查甲狀腺癌患者的病理資料，包括病理類型、臨床分期、組織學分化、發病位置、遠端轉移等。同時隨訪到2020年1月1日，記錄所有患者的生存情況。

2 結果

2.1 microrna-675、LncRNA LUCAT1、Actinin-4、IGF-1R表達水平比較 甲狀腺癌組microrna-675、LncRNA LUCAT1相對表達水平和血清IGF-1R值低于良性組，血清Actinin-4值高于良性組(P<0.05)。見表2。

表2 2組microrna-675、LncRNA LUCAT1、Actinin-4、IGF-1R表達水平比較

2.2 預后情況比較 隨訪到2020年1月1日，良性

組患者都存活；甲狀腺癌組中存活67例，存活率85.9%，比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

2.3 診斷價值分析 在156例患者中，ROC曲線分析microrna-675、LncRNA LUCAT1、Actinin-4、IGF-1R鑒別診斷甲狀腺癌的AUC值分別為0.843、0.807、0.811和0.837。

2.4 相關性分析 在甲狀腺癌患者中，Pearson分析顯示microrna-675、LncRNA LUCAT1、Actinin-4、IGF-1R表達水平與臨床分期、組織學分化、遠端轉移、預后都存在相關性(P<0.05)。見表4。

2.5 影響因素分析 在甲狀腺癌患者中，以患者的隨訪生存作為因變量，以臨床分期、組織學分化、遠端轉移、microrna-675、LncRNA LUCAT1、Actinin-4、IGF-1R表達水平等作為自變量，多因素Logistic回歸分析顯示臨床分期、組織學分化、遠端轉移、microrna-675、LncRNA LUCAT1、Actinin-4、IGF-1R表達水平都為影響患者預后的主要因素(P<0.05)。見表5。

3 討論

已有研究顯示甲狀腺癌發病率逐年增加不僅是因為過渡診斷，還與一些風險因素相關，如胰島素抵抗、環境致癌物和有限的治療手段[9]，這些因素對甲狀腺癌的發生發展至關重要。甲狀腺癌預后較好，5年存活率>90%，但是嚴重影響患者的生存質量，增加了生活壓力。目前，臨床主要依靠超聲、病理學等手段診斷，存在一定程度的漏診及誤診[10]。

甲狀腺癌的發生發展是多因素、多階段，多種癌基因相互作用的復雜過程，但是具體機制還不明確。本研究顯示甲狀腺癌組的microrna-675、LncRNA LUCAT1相對表達水平和血清IGF-1R值低于良性組，血清Actinin-4值高于良性組，差異有統計學意義(P<0.05)。從機制上分析，作為一類非編碼RNAs，在腫瘤的發生發展過程中發揮重要的作用，可調控細胞增殖、黏附、凋亡等重要過程，研究表明H19RNA通過提供miR-675，結合與CDH13基因，阻斷CDH13表達，進而促進甲狀腺癌細胞侵襲和遷移能力[11]。LncRNA可在表觀遺傳學水平、轉錄及轉錄后水平等調控基因的表達，從而參與腫瘤的增殖、侵襲和轉移等病理過程[12]。LUCAT1可以增加MYC蛋白的半壽期，也可影響細胞功能[13]；并且可以與miRNA200家族結合而影響miRNA200家族對靶基因的作用。LUCAT1具有癌基因的特性和潛質，在乳腺癌中表達上調[14]。細胞能動性在腫瘤細胞通過血液或淋巴侵入臨近組織或器官時至關重要，此時Actinin-4扮演重要角色。Actinin-4過表達與甲狀腺癌等腫瘤的不良預后和化療抵抗密切相關[15,16]。本研究發現，Actinin-4甲狀腺癌患者體內高表達，可能作為甲狀腺癌診斷標志物。IGF-1R在很多腫瘤中普遍表達，特異性抑制IGF-1R的功能(如選擇性小分子酪氨酸酶抑制劑)，可起到抗癌作用。甲狀腺癌細胞系和原發腫瘤樣本對IGF-1R抑制劑非常敏感。通過轉錄組和蛋白質組學分析發現，抑制IGF-1R具有抑制增殖和促進凋亡的多效性[17]。

甲狀腺癌是內分泌系統最常見的惡性腫瘤之一，隨著經濟飛速發展、生活方式改變、社會人口老齡化等問題，該病在我國的發生率逐年增加[18]。腫瘤相關信號通路調節異常、表觀遺傳學修飾等因素均參與了甲狀腺癌的發生發展過程[19]。本研究顯示隨訪到2020年1月1日，良性組患者都存活；甲狀腺癌組中存活67例，存活率85.9%，差異有統計學意義(P<0.05)；在156例患者中，ROC曲線分析microrna-675、LncRNA LUCAT1、Actinin-4、IGF-1R鑒別診斷甲狀腺癌的AUC值分別為0.843、0.807、0.811和0.837。

當前隨著城市化進程的加快，甲狀腺癌的發病率顯著升高。不過該病的增殖與侵襲是1個多步驟、多因素相互作用的復雜過程，具體的機制尚不清楚，明確甲狀腺癌的轉移與侵襲機制是當前研究領域的熱點[20]。基因異常和環境因素對甲狀腺癌的影響已經被廣泛研究，但是疾病進展過程中所包含的分子機制并不明確。大量miRNAs作為原癌基因或抑癌基因，參與了腫瘤的惡性發展進程[21]。本研究Pearson分析顯示microrna-675、LncRNA LUCAT1、Actinin-4、IGF-1R表達水平與臨床分期、組織學分化、遠端轉移、預后都存在相關性(P<0.05)；多因素Logistic回歸分析顯示臨床分期、組織學分化、遠端轉移、microrna-675、LncRNA LUCAT1、Actinin-4、IGF-1R表達水平都為影響患者預后的主要因素(P<0.05)。LUCAT1位于8號染色體長臂2區4帶，其位于MYC原癌基因3端60 KB的位置，不過LUCAT1和MYC對一些疾病的發生可發揮獨立的作用[22]。有學者發現microrna-675、在甲狀腺癌細胞系中表達降低，過表達microrna-675后可以抑制細胞活性、遷移和入侵能力，結果表明microrna-675作為腫瘤抑制因子，可調節甲狀腺癌發生發展進程[23,24]。不過本研究也有一定的不足，沒有進行臨床分析與實驗動物模型分析，并沒有系統篩選LUCAT1可能作用的蛋白質，實驗數據收集存在差異，可能也會影響結果的準確性，存在一定的研究偏倚，將在后續研究中深入分析。

綜上所述，甲狀腺癌患者伴隨有microrna-675、LncRNA LUCAT1、Actinin-4、IGF-1R的影響表達，與患者的臨床特征顯著相關，可用于鑒別診斷甲狀腺癌，且都是影響患者預后的重要因素。