不同產區‘紅燈’櫻桃香氣成分與產地生態因子相關性分析

邱 爽，劉 暢，謝美林，楊麗麗，魏陽吉 ，李景明,

（1.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083；2.中化現代農業有限公司，北京 100031）

食品香氣即食品風味物質中一小部分具有致香活性的物質[1]，雖然它們僅占水果鮮重的0.01%～0.001%，但這些物質是影響果實品質的重要因素，也是吸引消費者和鞏固市場的關鍵[2?3]。香氣被認為是植物相互交流和與環境相互作用的重要物質。果實香氣的形成受內在品種因素、外在環境因素（溫度、光照、濕度等）以及人為因素（栽培及采后管理等）的共同影響[4]，而在這眾多影響因素中，環境因素的影響最大[5?6]。Gachons等[7]研究發現長相思葡萄輕度缺水時的香氣物質含量最高，但嚴重缺水會限制香氣物質的積累。Deluc等[8]對赤霞珠和霞多麗葡萄的轉錄和代謝產物綜合分析結果也同樣表明長期和季節性缺水會影響葡萄果實的香氣。光照也是影響果實香氣合成的重要環境因子，如遮蔽光照可以通過抑制香氣合成途徑從而顯著降低香氣物質的含量[9?10]，紫外（UV-C）處理可以增加香氣合成過程中關鍵酶的活性促進酯類香氣的生成[11?12]。趙勝亭[13]研究香氣含量與生態因子的相關性發現年積溫、年降水量與蘋果香氣含量呈正相關關系，而海拔則與蘋果的香氣含量呈負相關。可見產地生態因子對果實香氣的組成有著極其重要的影響。

櫻桃（Cherry）是薔薇科，李屬類果實，在世界各地廣泛種植[14]。櫻桃中含有豐富的營養成分，具有極高的營養價值[15?17]。櫻桃香氣濃郁，其香氣已被國內外大量研究和報道[18?20]。每個地域都具有獨特的生態條件，即便同一果實品種在不同地區栽培，所產生的香氣物質也有很大的差異[21?22]，而有關不同產區櫻桃香氣的研究還未見報道，更未涉及到特定地域精確環境因子對櫻桃果實香氣的影響。

櫻桃的花期到果實成熟期一般為3月～5月，營養成分的積累也受到上一年氣候條件的影響。基于以上研究背景，本研究對5個產區‘紅燈’櫻桃樣品進行分析，包括西北地區（青海省、陜西省）、西南地區（四川省）、華北地區（山西省）、華東地區（山東省），跨度基本包括我國東、南、西、北，搜集5個產區2018年6月～2019年5月的氣象情況，并利用GCMS技術對‘紅燈’櫻桃香氣物質進行分析，通過主成分分析對5個產區‘紅燈’櫻桃的香氣物質進行了區分，最后借助Pearson相關性分析及冗余分析等數學分析手段系統探討了與櫻桃香氣物質的形成起顯著影響的環境因子，旨在為選擇合適的櫻桃栽培地域提供理論參考，以提高櫻桃的品種品質。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

5個產區‘紅燈’櫻桃 產地信息見表1；正構烷烴C7～C40、甲醇、乙醇 色譜純，上海安普（Anpel）實驗科技有限公司；無水乙醇、碳酸鈉、氯化鈉、PVPP、D-葡萄糖酸內酯 分析純，北京百靈威科技有限公司；2-壬酮 色譜純，美國Sigma-Aldrich公司。

BSA124S-CW型分析天平 德國塞利多斯公司；RZ-708H型干磨料理機 榮事達公司；GL-20GII型高速冷凍離心機 上海安亭科學儀器廠；Aglient 7890B型色譜儀、Aglient 5977B型質譜、HP-5MS UI 30×0.25 mm×0.25 μm毛細管色譜柱美國Agilent公司；聚二甲基硅氧烷/碳篩/二乙烯苯（DVB/CAR/PDMS）SPME萃取頭 美國Supelco公司。

表1 ‘紅燈’櫻桃樣品信息匯總Table 1 Summary of ‘Hongdeng’ cherry sample information

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的采集 櫻桃樣品采用隨機取樣法采樣，隨機選擇6株生長一致的櫻桃植株，按照商業成熟標準，從樣株外圍隨機采果5 kg后用保鮮盒盛裝，用帶有冰袋的保溫箱24 h內運輸至實驗室。挑選1 kg健康、大小和成熟度一致的果實，液氮快速冷凍后于?40 ℃儲存，待分析。提取5個采樣點的氣象資料（包括年日照時數、大于0 ℃年積溫、年降水量）及地形資料（海拔高度），氣象數據來自中國氣象科學數據中心網（http://data.cma.cn/）。

1.2.2 樣品制備 參照Chen等[23]的方法操作：取出存于?40 ℃冰箱中的櫻桃若干，液氮環境下去核初破碎，稱取約30 g櫻桃，依次加入0.60 g PVPP，0.30 g D-葡萄糖酸內酯后破碎成粉末，迅速轉移至50 mL離心管中，于4 ℃冰箱保存4 h。4 h后取出樣品于4 ℃、8000 r/min下離心15 min，取上清液，命名為澄清櫻桃汁備用。

1.2.3 頂空固相微萃取（HS-SPME） 參考Villière等[24]的方法并加以修改。取5 mL澄清櫻桃汁，加入10 μL濃度為8.22 mg/L的2-壬酮、1 g NaCl和磁力轉子于20 mL頂空瓶中，加蓋密封后置于磁力攪拌臺上，40 ℃下平衡30 min，待平衡后將老化后的SPME萃取頭插入頂空瓶，萃取頭距液面1 cm，40 ℃下吸附30 min，吸附結束拔出萃取頭，插入GC-MS進樣口，250 ℃下熱解析8 min。

1.2.4 GC-MS分析 參考Wen等[18]的方法并加以修改。櫻桃香氣物質檢測的色譜條件：載氣為高純氦氣（He>99.999%），流速1 mL/min，不分流進樣。進樣口溫度為250 ℃，熱解析時間為8 min。升溫程序為：40 ℃保持3 min，然后以5 ℃/min的速度升溫到85 ℃，保持2 min，然后以2 ℃/min的速度升溫到130 ℃，保持2 min，再以6 ℃/min的速度升溫到210 ℃，保持2 min，以10 ℃/min的速度升溫到250 ℃，保持2 min。質譜電離方式為EI，離子能量70 eV，掃描范圍為40～450 amu。

1.2.5 揮發性成分的定性、定量分析 GC-MS實驗結果由NIST17數據庫的相似度檢索并結合參考文獻中相應化合物的保留指數雙重定性。將正構烷烴（C7～C40）標準品直接液體上樣分析，計算保留指數，通過與NIST17數據庫參考文獻中相應物質的保留指數進行對比，對樣品中的香氣成分進行定性分析。保留指數計算公式如式（1）：

式中：t（x）、t（n）、t（n+1）分別為待測物x、具有n個、n+1個碳原子正構烷烴的保留時間。

利用內標法對香氣物質進行定量，計算公式如式（2）：

式中：Cx和Mx分別為待測香氣物質的濃度（mg/L）和峰面積；Cy和My分別為內標物（2-壬酮）的濃度（mg/L）和峰面積。

1.2.6 相關性分析 Pearson相關性分析常被用于分析兩個變量X和Y之間的關系密切程度，可以評估二者之間的線性關系。對于變量X=[x1, x2, ···,xn]T和Y=[y1, y2, ···, yn]T，其相關系數r的取值為[?1,1]，接近0代表無相關性，接近1或?1代表強相關性。計算公式如式（3）[25]：

1.3 數據分析

采用SPSS 24.0進行數據的統計學分析；主成分分析、Pearson相關性分析及可視化由R（Rx64 3.6.3）軟件分析繪制；冗余分析由Canoco 5軟件分析。

2 結果與分析

2.1 GC-MS分析結果

通過GC-MS對5個不同產地‘紅燈’櫻桃中的香氣物質進行定性、定量分析，共鑒定出32種香氣成分，大多數物質在先前的文獻已被報道[18?19]。其中醛類9種，萜烯類7種，酯類6種，醇類5種，酮類4種，酸類種類較少，僅有1種。每種櫻桃香氣物質的平均質量濃度見表2。

不同產地櫻桃樣品間香氣物質的含量和種類均存在差異，利用R軟件對香氣物質在種類上的差異可視化繪制韋恩圖，如圖1，圖中不同數字表示5個產地‘紅燈’櫻桃特有或共有的香氣物質種類數，可得所有櫻桃樣品共有的香氣物質為11種。山東福山‘紅燈’櫻桃所含香氣種類最豐富，共鑒定出22種化合物，其中8種為山東‘紅燈’櫻桃特有的香氣物質。青海和陜西‘紅燈’櫻桃特有的香氣物質均為一種醛類和一種酯類，青海‘紅燈’特有香氣為月桂醛和4-己烯-1-醇乙酸酯，其中4-己烯-1-醇乙酸酯含量較高，占香氣總量的18.71%。陜西‘紅燈’特有香氣為（E,E）-2,4-庚二烯醛和苯甲酸乙酯，但含量均較低。山西‘紅燈’櫻桃香氣種類含量最少，僅有15種，無特有香氣物質。

圖2展示了不同產地櫻桃香氣含量的差異，5個櫻桃樣品中山西‘紅燈’櫻桃香氣總量最高（65198.10 μg/L），陜西‘紅燈’櫻桃香氣總量最低（23493.07 μg/L）。

醛類物質是櫻桃香氣中最主要的組分，這在先前的研究報道中已得到了證實[28]。C6醛類和芳香醛類，如己醛（青綠香氣）、（E）-2-己烯醛（蘋果和青綠味）、苯甲醛（苦杏仁、櫻桃、堅果味）是‘紅燈’櫻桃的重要香氣物質，在所有產地‘紅燈’櫻桃中均含量較高，這與Zhang等[29]先前對‘紅燈’櫻桃的香氣研究結果一致。此外，壬醛、癸醛也是所有櫻桃樣品共有的醛類香氣，具有一定的青綠和柑橘味[19]。山西‘紅燈’櫻桃含有極高的醛類香氣，主要是己醛和（E）-2-己烯醛，分別占其香氣總量的45.96%和47.37%，這也是導致山西‘紅燈’香氣含量最高的主要原因。

醇類、酮類、萜烯類和酯類香氣含量遠低于醛類香氣，且在5個產區櫻桃樣品中含量差異較大。山東‘紅燈’櫻桃醇類香氣含量最高，其次是四川‘紅燈’櫻桃，兩產區‘紅燈’櫻桃醇類香氣含量相差不大，值得注意的是，四川‘紅燈’櫻桃特有的醇類香氣—“3-己烯醇”含量較高，占其醇類香氣總量的60%以上，具有較強的青綠味和脂肪味。山東‘紅燈’櫻桃酮類香氣含量仍最高，青海‘紅燈’櫻桃次之，而其余3個產區‘紅燈’櫻桃酮類香氣含量較低，均不及山東和青海‘紅燈’櫻桃酮類香氣的一半。對于萜烯類香氣，山東和山西‘紅燈’櫻桃含量較高，陜西‘紅燈’櫻桃萜烯類含量最低，僅為292.04 μg/L，其余4種櫻桃萜烯類香氣含量達到其2.97～5.95倍。青海‘紅燈’櫻桃酯類香氣含量最高（5874.91 μg/L），酯類香氣占其香氣總量的18.88%，而其余產區‘紅燈’櫻桃酯類香氣含量相對較低，主要因為青海‘紅燈’櫻桃具有極高的4-己烯-1-醇乙酸酯，占其酯類香氣的99.12%。就酸類香氣而言，僅在山東‘紅燈’櫻桃中檢測出一種酸類物質壬酸，且含量極低。由此可以看出，山東‘紅燈’櫻桃醇類、酮類、萜烯類和酸類香氣含量均為最高，但因山東‘紅燈’櫻桃中醛類香氣含量與山西‘紅燈’櫻桃差距較大，使得山東‘紅燈’櫻桃在5個產區中香氣總量排名第二。

表2 櫻桃果實香氣物質質量濃度Table 2 Concentration of aroma compounds in cherry fruit

圖1 不同產地‘紅燈’櫻桃樣品香氣種類差異圖Fig.1 Different aroma types of ‘Hongdeng’ cherry from different regions

2.2 PCA分析結果

為進一步從整體上反應不同產地‘紅燈’櫻桃香氣成分的差異，以5個產地‘紅燈’櫻桃樣品為分析對象，采用主成分分析對32種香氣成分進行分析，結果如圖3（a，b）所示。從圖3可以看出，前兩個主成分提取了總方差的74.9%，可解釋樣本的大部分信息。由主成分得分圖（圖3a）可以看出不同產地的櫻桃分布在不同象限內。山西和山東產櫻桃的離散度較大，分別位于第二和第四象限內，表明二者對主成分貢獻較高。四川產櫻桃與青海產櫻桃離散度較低，說明二者香氣結構較為相似，可聚為一類，但對主成分的貢獻率不高。陜西產櫻桃位于第三象限內，對主成分貢獻率較高，與第一主成分和第二主成分均呈負相關關系。

圖2 不同產地‘紅燈’櫻桃香氣含量差異圖Fig.2 Difference of aroma content of ‘Hongdeng’cherry from different regions

進一步分析后得到PCA載荷圖（圖3b）。cos2值用來衡量某變量的有用程度，其值越大，該主成分貢獻值越大，此時變量在相關曲線圖中位于圓的邊緣。同時點的大小及顏色的深淺也代表了不同變量對主成分的貢獻程度。山西產櫻桃與1-己醛、6-甲基-5-庚烯-2-酮、橙花醇等香氣物質顯著相關，四川、青海產櫻桃與3-己烯醇、月桂醛、4-己烯-1-醇乙酸酯、脫氫二氫-β-紫羅蘭酮相關性較強，而陜西產櫻桃僅與（E,E）-2,4-庚二烯醛、苯甲酸乙酯顯著相關。與山東產‘紅燈’櫻桃密切相關的香氣物質較多，主要是萜烯類香氣和山東產櫻桃特有的酸類香氣壬酸。可見不同產地的‘紅燈’櫻桃香氣成分有很大的差異，因此下文對櫻桃香氣物質與一系列生態因子進行了相關性分析，以期觀察生態因子對櫻桃香氣的影響。

圖3 不同產地‘紅燈’櫻桃香氣的主成分得分圖（a）與載荷圖（b）Fig.3 The PCA scores plot (a) and loading plot (b) of volatile compounds in ‘Hongdeng’ cherry in different regions

2.3 相關性分析結果

為確定產地生態因子與香氣物質間的關系，對GC-MS分析結果中不同種類香氣物質的含量數據和各生態因子數據進行Pearson線性相關分析，結果見表3。由表3可以發現年日照時數與酮類香氣顯著相關（R2=0.890）(P<0.05)，與酸類（R2=0.817）、萜烯類（R2=0.752）香氣相關性較強。年積溫與酯類香氣達到極顯著負相關（R2=?0.979）(P<0.05)。從上文圖2中得知山東產櫻桃含有最高的酮類、醇類、酸類、萜烯類香氣，究其原因可能是因為山東地區的年日照時數最高，從而促進了香氣物質的積累。青海產櫻桃的酯類香氣含量極高，但年積溫最低，表明隨著年積溫的升高，櫻桃酯類香氣物質含量反而呈現下降趨勢。醇類、醛類香氣含量受產地生態因子影響較小，海拔對‘紅燈’櫻桃果實香氣物質含量無較大影響。

表3 櫻桃香氣種類與產地生態因子間Pearson相關系數表Table 3 Pearson correlation coefficient between cherry aroma species and environmental ecological factors

進一步對每種香氣物質相對含量與各生態因子間相關性進行分析，結果見圖4，共有7種香氣物質與生態因子數據達到顯著（P<0.05）或極顯著相關（P<0.01）。

雖然海拔與各香氣物質含量相關性不強，但海拔高度直接關系到果實生長的溫度、濕度和其他影響果實成熟的環境因素。由圖4可知，海拔與75%香氣物質均呈現負相關關系，僅與3-己烯醇、月桂醛、4-己烯-1-醇乙酸酯、橙花醇、β-大馬士酮等8種香氣物質呈現一定的正相關，這與Yue等[30]研究發現隨著海拔的升高，葡萄果實總揮發物的濃度降低的研究結果相一致。年降水量與84.4%的香氣物質呈現負相關關系，但與3-己烯醇（R2=0.977）呈現顯著正相關，與β-大馬士酮（R2=0.834）正相關性較強。先前的研究表明限制供給水分能夠增加果實香氣物質的含量[31?32]，特別是水分不足會增加脂氧合酶（LOX）和氫過氧化物裂解酶（HPL）的轉錄豐度，從而產生更高水平的C6醛[8]，本文顯示1-己醛（R2=?0.222）、（E）-2-己烯醛（R2=?0.399）含量與降水量呈現負相關關系，研究結果支持這一結論，但并不顯著。關于年降水量與果實香氣間的關系，本研究與趙勝亭[13]研究發現的年降水量與蘋果香氣成分含量呈正相關關系的結論稍有出入，分析原因可能是不同果實香氣物質的形成與代謝存在一定的差異。年積溫與84.4%的香氣物質呈現正相關，與5種香氣物質呈現負相關關系，其中與辛醛（R2=?0.895）達到顯著負相關（P<0.05），與月桂醛（R2=?0.974）、4-己烯-1-醇乙酸酯（R2=?0.974）、脫氫二氫-β-紫羅蘭酮（R2=?0.979）呈現極顯著負相關（P<0.01）。

圖4 產地生態因子與GC-MS分析結果之間的相關性熱圖Fig.4 Heatmap cluster of the correlation efficients between ecological factors and volatile compounds

年日照時數與‘紅燈’櫻桃中75%的香氣物質呈現正相關關系，特別是與香葉基丙酮和2-乙基-1-己醇兩種香氣呈現顯著正相關（P<0.05），表明隨著年日照時數的增加，這兩種香氣物質含量會顯著提高。之前的文獻報道脂肪醇類香氣含量與日照時數呈正相關[33]，本研究結果中的脂肪醇除3-己烯醇外，其余脂肪醇濃度均與日照時數呈正相關，與先前的研究結果一致。可見不同產地生態因子與櫻桃香氣物質間具有一定的相關性。

2.4 RDA分析結果

RDA分析又叫多元直接梯度分析，可以展示環境因子、產地及香氣三者之間或者兩兩之間的關系。觀察圖5得知，除海拔和年降水量外，環境因子間無明顯交互作用。海拔、年降水量與各香氣物質含量之間相關性較為相似，均與3-己烯醇、β-大馬士酮、橙花醇等香氣物質呈正相關關系，與第一象限的多種香氣物質呈現負相關關系。年日照時數與各香氣物質含量之間的相關性不強，而年積溫與多種香氣物質均呈現較為顯著的負相關關系，如辛醛、月桂醛、4-己烯-1-醇乙酸酯、脫氫二氫-β-紫羅蘭酮、香葉基丙酮等。

圖5 ‘紅燈’櫻桃香氣物質與產地生態因子間RDA分析Fig.5 RDA analysis between volatile compounds of‘Hongdeng’ cherry and ecological factors

觀察產地、香氣與生態因子三者之間的關系，可以看出四川產櫻桃含有較高的3-己烯醇，海拔、年降水量與3-己烯醇呈現正相關關系，從四川的地形與環境來看，四川地區的海拔及年降水量在五個地區中均位于首位，類似的還有橙花醇和β-大馬士酮。陜西產櫻桃特有的（E,E）-2,4-庚二烯醛和苯甲酸乙酯可以歸因于與之呈現負相關關系的年日照時數，因為陜西地區2018～2019年日照時數最低。山西產櫻桃具有極高的1-己醛、（E）-2-己烯醛以及相對較高的壬醛和癸醛等醛類香氣物質，主要因為山西地區常年溫度較高，在五個產區中年積溫最高。山東地區的櫻桃酮類香氣如香葉基丙酮和萜烯類香氣物質如β-月桂烯、里那醇等含量相對較高，這是因為山東地區年日照時數較長，而對于青海產櫻桃來說，因4-己烯-1-醇乙酸酯的含量極高導致其具有最高的酯類香氣，青海地區的年積溫最低，在上文中也得到了年積溫與酯類香氣物質呈負相關關系的結論。以上結果與上文中香氣物質含量與各生態因子的Pearson相關性分析結果相一致，均表明不同產地‘紅燈’櫻桃香氣物質之間具有一定的差異，而生態因子，特別是年積溫、年日照時數和年降水量是造成這些差異的重要原因。

3 結論

本研究以我國5個地區的‘紅燈’櫻桃為試驗對象，采用GC-MS技術對5個櫻桃樣品的香氣特征及差異進行分析。結果表明不同產地‘紅燈’櫻桃香氣在種類和含量上均具有一定的差異，而環境生態因子是造成這種差異的重要原因。

通過Pearson相關性分析和RDA分析探討了櫻桃香氣物質與產地生態因子間的相關性，結果表明，年日照時數、年積溫以及年降水量對‘紅燈’櫻桃香氣影響較大。其中年日照時數與多數香氣物質含量呈現正相關關系，特別是與酮類香氣含量達到極顯著正相關。年積溫雖與大多數香氣呈現正相關，但與酯類香氣達到極顯著負相關。對于年降水量來說，除醇類香氣外，其余種類香氣物質含量均隨著年降水量的升高而呈現下降趨勢。

目前關于環境因子對櫻桃香氣的影響少有研究，具體是哪個環境因子起主要作用，影響機制是什么尚不明確，這都需要進一步的探究。從本研究結果來看，環境對果實香氣具有很大的影響，在未來櫻桃的種植中，可以根據不同地區的環境氣象因子，適當的改變種植環境，如年降水量較高的地區可以適當減少水分的補充，常年溫度較低、日照時數較短的產區可以通過大棚保溫、適當人工調節光照以提高溫度和日照，從而提高櫻桃的香氣品質。