HPLC?MS／MS 法分析中華常春藤與洋常春藤化學成分

倪力軍諸葛 敏高麗麗胡江寧金漢臺金志文

（1.華東理工大學化學與分子工程學院，上海200237； 2.中國醫學科學院藥物研究所，北京100050；3.浙江康恩貝中藥有限公司，浙江 麗水323400）

中華常春藤Hedera nepalensisvarK.Koch var.sinensis（Tobl.）Rehder 和洋常春藤Hedera helixL 為五加科常春藤屬的2 個亞種，兩者在我國大部分地區均有分布。中華常春藤藥用價值被許多中藥典籍記載［1］，功能主治祛風利濕、活血化瘀、平肝、解毒，可用于治療風濕關節急性結膜炎等病癥。洋常春藤原產于歐洲和北非［2］，已被列入歐洲藥典［3］，其乙醇提取物具有止咳解痙、抗炎、抗病毒、抗氧化、抗癌等作用［4?5］，但國內對其藥用研究較少。文獻記載表明中華常春藤和洋常春藤的臨床適應癥不同。對比研究兩者化學成分的異同對于開發以常春藤為原料的植物新藥具有重要意義。

常春藤屬植物主要含五環三萜皂苷、黃酮類、多酚類和有機酸等成分。Kanwal 等［6］、Saleem 等［7］、Jafri 等［8］研究中華常春藤時分別使用甲醇、正己烷、乙酸乙酯、水進行提取，發現各相提取物中主要含有黃酮、固醇、三萜皂苷和強心苷類成分。洋常春藤中被研究最多、生物活性較好的成分主要為三萜皂苷類（占比2.5%～6%）［5］，洋常春藤還含有其他成分［9］，如黃酮類、酚酸類、花色苷類、香豆素類、生物堿、揮發油、維他命、碳水化合物。但對比中華常春藤和洋常春藤化學成分的研究尚未見報道。本研究使用HPLC?MS／MS 對2 種常春藤中化學成分進行定性鑒別和對比分析，從成分種類和化學結構層面上了解其化學成分的異同。

1 材料與方法

1.1 儀器 XSE105DU 電子天平［十萬分之一，梅特勒?托利多儀器（上海）有限公司］；Mili?Q 超純水儀（美國Millipore 公司）；Thermo UltiMate 3000 高效液相色譜儀、Thermo Q?Exactive Plus MS／MS 質譜儀（美國Thermo Fisher公司）；DS?3510 DTH 超聲波清洗器（上海生析超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥物 甲醇（色譜純，德國Merck 公司）；甲酸（分析純，上海凌峰化學試劑有限公司）；超純水采用純水儀自制。對照品隱綠原酸（色譜純，上海柏卡化學技術有限公司）；常春藤皂苷C（色譜純，浙江康恩貝制藥股份有限公司）；α?常春藤皂苷、秦皮甲素（色譜純，中國食品藥品檢定研究院）；綠原酸、蘆丁、煙花苷、常春藤皂苷B、常春藤皂苷D（色譜純，南京春秋生物工程有限公司）。

洋常春藤干燥葉批號為HZ170402，于2017 年4 月1日采摘于浙江杭州市；中華常春藤干燥葉批號為ZH180423，于2018 年4 月23 日采摘于浙江省松陽縣，均由浙江康恩貝中藥有限公司提供，經中國中醫科學院中藥研究所陳士林教授鑒定為五加科常春藤屬洋常春藤Hedera helixL.、中華常春藤Hedera nepalensisvarK.Koch var.sinensis（Tobl.）Rehder。

1.3 供試品溶液制備 精密稱量洋常春藤、中華常春藤干燥葉（40 目）0.5 g，以料液比1 ∶100 加入80% 甲醇，80 ℃水浴回流提取1 h，補足減失質量，過0.22 μm 微孔有機相濾膜，取續濾液，即得。

1.4 對照品溶液制備 精密稱定各對照品適量于量瓶中，加入甲醇超聲溶解，放冷，甲醇定容至刻度，即得。

1.5 分析條件

1.5.1 色譜 Hypersil Gold C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，3 μm）；流動相0.05% 甲酸（A）?甲醇（B），梯度洗脫（0～1.5 min，5% B；1.5～5 min，5%～20% B；5～15 min，20%～40%B；15～30 min，40%～70%B；30～34 min，70%～90%B；34～37 min，90%B；37～40 min，90%～5%B）；體積流量0.3 mL／min；檢測波長205 nm；進樣量2 μL。

1.5.2 質譜 采用電噴霧離子化源（ESI）；正負離子模式檢測；Full MS 一級掃描，分辨率70 000；dd?MS2模式二級掃描，分辨率17 500；鞘氣體積流量45 μL／min；噴霧電壓3.50 kV；輔助氣體積流量15 μL／min；輔助氣溫度250 ℃；毛細管溫度375 ℃；質量掃描范圍m／z150～2 000。

2 結果

洋常春藤和中華常春藤的正、負總離子流圖見圖1～2，正離子模式相對負離子模式出峰更多且信號更強，故解析化學成分以正離子模式信息為主。正離子模式下，共從2種常春藤中鑒定或推斷出48 種成分，見表1，可大致將其分為有機酸、黃酮苷、皂苷3 個結構大類；負離子模式下，補充推斷出5 種成分，見表2。解析時使用Xcalibur 軟件打開數據文件，由一級譜數據獲得準分子離子峰，隨后將準分子離子峰二級譜的碎片信息與文獻［6?17］、質譜數據庫網站對比進行深入鑒定。

圖1 正離子模式下中華常春藤、洋常春藤總離子流圖

表1 正離子模式下洋常春藤、中華常春藤葉中化學成分

表2 負離子模式下洋常春藤、中華常春藤葉中化學成分

一般來說，中藥中的類似成分通常具有相似的結構，特征化合物通過連接不同的化學基團，包括羥基、甲氧基、乙酰基、甲基以及與糖基脫水縮合形成新的化合物［10］。糖基通常為葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖、葡萄糖醛酸。

圖2 負離子模式下中華常春藤、洋常春藤總離子流圖

2.1 有機酸類化合物鑒定 液質分析表明，2 種常春藤中均含有綠原酸異構體，它是由咖啡酸和奎尼酸縮合而成的一種酯類化合物［14］，因其縮合位置不同有多種同分異構體。綠原酸類化合物有3 個保留時間，分別為6.78、7.44、7.70 min，一級碎片信息有m／z355.102 4 ［M＋H］＋、m／z377.084 1 ［M＋Na］＋、353.087 4 ［M?H］－，正離子模式二級碎片信息m／z193.049 4、m／z163.038 8 分別是［M ＋H］＋脫去咖啡酸、奎尼酸的碎片。結合參考文獻［11］ 并根據分子空間對稱結構判斷極性大小為新綠原酸＞綠原酸＞隱綠原酸，并由對照品比對出綠原酸和隱綠原酸的出峰時間為7.40、7.80 min，所以保留時間為6.78 min 的峰為新綠原酸。3 種綠原酸裂解途徑類似，以綠原酸為例，其正離子模式下可能的碎裂途徑見圖3。

圖3 正離子模式下綠原酸的質譜圖及可能裂解途徑

中華常春藤在tR為14.84、15.69 min 處檢測到一級碎片信息為m／z517.134 0 ［M ＋H］＋、m／z539.115 7 ［M ＋Na］＋、m／z515.118 7 ［M?H］－，洋常春藤中未檢出該成分，推測其為一分子咖啡酸與兩分子奎尼酸縮合位置不同形成同分異構體，可能成分有1，5?dicaffeoylquinic acid、3，4?dicaffeoylquinic acid、3，5? dicaffeoylquinic acid 和4，5?di?caffeoylquinic acid［16］。

2.2 黃酮苷類化合物鑒定 黃酮類化合物結構中常連接有酚羥基、甲氧基、甲基、異戊烯基等官能團，還常與糖結合成苷，此類化合物在碎裂時會丟失糖基碎片［10］。液質結果表明，常春藤中黃酮苷類化合物有蘆丁、煙花苷、阿福豆苷。蘆丁為槲皮素與一分子鼠李糖和一分子葡萄糖脫水縮合形成，一級碎片信息有m／z611.160 9 ［M ＋H］＋、m／z633.142 1 ［M＋Na］＋、m／z609.145 3 ［M?H］－，正離子模式二級碎片信息m／z465.102 4 為［M＋H］＋脫去一分子鼠李糖 基（m／z146.058 5）、m／z303.049 5 為 ［M?鼠 李糖＋H］＋進一步脫去一分子葡萄糖基（m／z162.052 6）。以蘆丁為例，給出了黃酮苷類成分丟失糖基碎片的可能裂解途徑，見圖4。

圖4 正離子模式下蘆丁的質譜圖及可能碎裂途徑

煙花苷（tR17.37 min）為一分子山柰酚與一分子鼠李糖和一分子葡萄糖脫水縮合形成，一級碎片信息有m／z595.165 7 ［M ＋H］＋、m／z617.147 5 ［M ＋Na］＋、m／z593.149 5 ［M?H］－，二級碎片信息m／z449.107 5、m／z287.054 7 分別為［M?鼠李糖＋H］＋、［M?鼠李糖?葡萄糖＋H］＋。阿福豆苷（tR8.42 min）為一分子山柰酚和一分子鼠李糖脫水縮合形成，一級碎片信息有m／z433.134 1 ［M＋H］＋、m／z455.115 9 ［M＋Na］＋、m／z431.118 3 ［M?H］－。

2.3 皂苷類化合物鑒定 皂苷類化合物主要以常春藤皂苷元、齊墩果酸為母核，連接糖鏈而成。其中含量較高、活性較強的皂苷為常春藤皂苷C 和α?常春藤皂苷［5］。對照品對比，鑒定tR為27.84 min 的峰為常春藤皂苷C，其由一分子hederagenin、兩分子鼠李糖、一分子阿拉伯糖和兩分子葡萄糖縮合而成，一級碎片信息有m／z1 221.626 8 ［M＋H］＋、m／z1 243.606 8 ［M ＋Na］＋、m／z121 9.606 8 ［M?H］－、m／z1 265.613 0 ［M＋HCOO］－，正離子模式下常春藤皂苷C 碎片過于破碎，不利于解析，故用負離子模式下的信息進行解釋。負離子模式下其二級碎片信息m／z1 073.549 8、749.446 0 分別對應［M?鼠李糖?H］－、［M?鼠李糖?2 葡萄糖?H］－，常春藤皂苷C 可能的碎裂途徑見圖5。

圖5 負離子模式下常春藤皂苷C 的質譜圖及可能碎裂途徑

與α?常春藤皂苷對照品比對，鑒定tR34.12 min 的峰為α?常春藤皂苷，由一分子hederagenin、一分子鼠李糖和一分子阿拉伯糖縮合而成，一級碎片信息有m／z751.462 5［M ＋H］＋、m／z773.444 5 ［M ＋Na］＋、m／z749.446 9［M?H］－，二級碎片信息有m／z619.419 8、473.362 3、455.351 4、437.340 9、409.346 1 分別對應［M?阿拉伯糖＋H］＋、［hed?eragenin ＋H］＋、［hederagenin?H2O ＋H］＋、［hederagenin?2H2O＋H］＋、［hederagenin?2H2O?CO＋H］＋。

2.4 成分對比 結果表明，中華常春藤和洋常春藤在所含化學成分上有許多共同特征，成分結構也基本相同，51 組峰中共有峰有39 組。中華常春藤中有二咖啡酰奎尼酸、臺灣常春藤XII 等16 種洋常春藤中沒有的成分；洋常春藤中有新綠原酸、常春藤皂苷D 等6 種中華常春藤中沒有的成分。

信號較強成分，如蘆丁、煙花苷、常春藤皂苷C、α?常春藤皂苷等成分在中華常春藤和洋常春藤中均有分布，且這幾種成分為常春藤主要活性成分，表明這2 種常春藤主要成分相同，特異性分布成分多為含量較低組分。根據液質分析比較，推測2 種常春藤的主要活性成分含量不同、各自獨有的成分與其他化合物的協同作用，可能是2 種藥材體現出不同臨床作用的原因。

3 討論

植物學上主要是依據葉片外觀形貌和其顯微圖像的絨毛特征區分中華常春藤和洋常春藤。本研究較為系統地定性分析、比較了中華常春藤和洋常春藤葉中的化學成分，結果表明2 種常春藤中的大類化學成分相同。由于對照品的稀缺，一些同分異構體成分還需要通過核磁等方法進一步研究來佐證。但中華常春藤所含化學成分相對較多，表明中華常春藤和洋常春藤存在差異。由于本研究分析樣品有限，進一步可收集更多樣品，借鑒文獻［18］ 的做法，對2 種常春藤進行近紅外光譜及HPLC 指紋圖譜分析，采用多元統計分析方法根據分子光譜提供的整體信息進行2種藥材的快速區分與鑒別；根據指紋圖譜間進行整體相似度評價，根據主要組分含量的統計學差異比較其共有成分含量的差異。