水稻種子蛋白質的組成和積累形態對稻米品質的影響

劉慧芳 吳孚桂 聶佳俊 韋云飛 馬啟林

摘? 要：設置水培試驗對‘16-17（谷蛋白前體聚合物明顯，含量高）和‘16-20（谷蛋白前體聚合物不明顯，含量低）分別進行CK（氮2800 μmol/L，硫80 μmol/L）、N（氮3640 μmol/L，硫80 μmol/L）、S（氮2800 μmol/L，硫260 μmol/L）、N+S（氮3640 μmol/L，硫260 μmol/L）處理，以此改變稻米品質和稻米貯藏蛋白質的組成與含量，從而對稻米蛋白質各組分及相關品質性狀進行分析。結果表明：（1）在N、S和N+S的不同處理下均增加了粗蛋白的含量，使‘16-20的稻米粗蛋白百分含量分別增加2.35%、2.67%和2.73%;（2）在2個品種的各組分蛋白含量變化中，‘16-17的醇溶蛋白和谷蛋白的百分含量在N、S和N+S下較對照分別增加了9.75%、4.21%和4.67%，3.92%、7.38%和12.92%。‘16-20的谷蛋白百分含量在S和N+S處理下增加了17.72%和29.38%，醇溶蛋白百分含量在N+S下增加了3.73%，而球蛋白百分含量在N、S和N+S三個處理下降低了2.86%、3.78%和3.69%，清蛋白在N、S處理下顯著降低;（3）谷蛋白的2個亞基的相對含量和57 kDa谷蛋白前體及57 kDa以上谷蛋白聚合體的積累在‘16-20品種中明顯增加。（4）稻米品質中，N、S配施對2個參試品種的碾磨品質性狀的影響不明顯，但有利于2個品種稻米外觀品質和食味品質的改善，并使‘16-20的營養品質顯著增加，另外，‘16-20的千粒重在S和N+S處理下顯著增加。故不同N、S配施處理下，不同品種水稻貯藏蛋白質的組成和積累形態差異很大，并改變了含巰基蛋白質組分的積累量和積累形態。尤其是在富S條件下，蛋白質積累過程中形成較多的巰基及二硫鍵，并通過二硫鍵來改變含巰基的蛋白質亞基之間的聚合程度，形成不同分子量的谷蛋白聚合體，使蛋白質的積累形態發生明顯改變，進而使稻米相關品質性狀發生改變。

關鍵詞：水稻;種子蛋白;蛋白組分;稻米品質

中圖分類號：S511? ? ? 文獻標識碼：A

Effects of Rice Seed Protein Composition and Accumulation Morphology on Rice Quality

LIU Huifang， WU Fugui， NIE Jiajun， WEI Yunfei， MA Qilin*

College of Tropical Crops， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

Abstract： A hydroponic test is set for the processing of CK （nitrogen 2800 μmol/L， sulfur 80 μmol/L）， N （nitrogen 3640 μmol/L， sulfur 80 μmol/L）， S （nitrogen 2800 μmol/L， sulfur 260 μmol/L） and N+S （nitrogen 3640 μmol/L， sulfur 260 μmol/L） for the ‘16-17 （with high content of the precursor polymer of glutelin） and ‘16-20 （with low content of the precursor polymer of glutelin）， by changing the rice quality and the composition and content of rice storage protein， in order to analyze the rice protein components and related quality traits. The crude protein content increased under different processing of N， S and N+S， that of ‘16-20 significantly increased by 2.35%， 2.67% and 2.73%. The content of prolamin and glutelin of ‘16-17 increased by 9.75%， 4.21% and 4.67%， 3.92%， 7.38% and 12.92%， respectively for the two varieties. The glutelin content of ‘16-20 significantly increased by 17.72% and 29.38% under the processing of S， the prolamin content increased by 3.73% under the processing of N+S，the percentage of globulin was reduced by 2.86%， 3.78% and 3.69% under the processing of N， S and N+S.， and the albumin significantly reduced under the processing of N and S. The relative content of the two subunits of glutelin， 57 kDa glutelin precursor and glutelin polymer obviously increased in ‘16-20. With regard to rice quality， the combined application of N and S didnt generate obvious impact on the grinding quality of the two varieties， but was conductive to improving the appearance quality and taste quality of the two varieties， and significantly increased the nutritional quality of ‘16-20. Besides， the thousand seed weight of ‘16-20 significantly increased under the processing of S and N+S. Hence， under the combined application of N and S， the protein stored in different varieties of rice has great difference in the component and accumulation form， and changes the accumulation amount and accumulation form of the compounds containing sulfydryl proteins. Especially in the condition of abundant S， the protein forms much sulfydryl and disulfide bond in the accumulation process and changes the polymerization contents among protein subunit containing the sulfydryl through disulfide bond to form glutelin polymer with different molecular weight. As a result， the accumulation form of the protein has obvious change， further changing the relevant quality of rice.

Keywords： rice; seed protein; protein component; rice quality

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.04.030

水稻（Oryza sativa L.）是全球一半以上人口的主要糧食作物，也是植物蛋白的主要來源，它為全世界超過30億的人提供了25%的能量[1-3]。而隨著生活質量的逐步改善，人們對優質大米的需求今后也會強勁增長。水稻種子的主要營養成分是淀粉、儲藏蛋白質、氨基酸、脂質等，其中大部分是淀粉和蛋白質，它們的重量合計占谷物干物質重量的90%以上[4-5]。大米中含有直鏈和支鏈2種淀粉，并且2種淀粉的形態結構和所占比例對大米的許多品質特性有重要影響[6]。除淀粉之外，水稻種子中的蛋白質和氨基酸含量以及它們的相對平衡是決定水稻營養價值的最重要因素[3， 7]。大米中的儲藏蛋白質含量和組成對其蒸煮食味品質、營養價值、大米的外觀和加工品質等都有重要的影響[8]。

水稻種子的蛋白質含量屬于典型的數量性狀，遺傳變異豐富，同時品種間的遺傳基礎差異也非常大，并且容易受不同環境因素和栽培技術的影響[9]。不同施肥處理對水稻產量、食味品質及蛋白質組分的影響不同，其中以氮素的施用對其影響最大[10]，因為氮素是蛋白質成分中的重要元素之一。另外，硫也是構成蛋白質的主要成分之一，提高硫素水平可以提高巰基含量，使含有-SH 氨基酸中半胱氨酸和甲硫氨酸通過-S-S-形成高分子量的聚蛋白，進而使其蛋白的結構和功能發生相應變化。并且，由于氮和硫的密切關系，在氮供應充足的條件下，硫肥的施用往往對產量都有明顯的增產效應，Luo等[11]的研究發現，在僅僅施用硫肥的情況下稻米的相關品質不會發生顯著變化，硫肥對稻米品質的影響只有在施加一定量氮肥的前提下才會發生明顯的改變。

關于水稻蛋白質各組分與稻米品質的關系方面的研究較少，現有的研究主要集中在氮、硫對水稻產量和粗蛋白含量的影響，以及氮、硫對水稻稻米品質的影響，而對水稻中各蛋白的代謝與積累形態對稻米品質影響的研究尚未見詳細報道。另外，蛋白的其他組分對稻米品質的影響如何尚不清楚。本研究在水稻生產過程中，通過氮、硫配施，改變水稻種子蛋白的含量、組成和積累形態，進而分析對稻米品質有何影響，旨在研究水稻種子蛋白積累形態對稻米品質的影響，從而為提高水稻種子蛋白含量并改善稻米品質提供參考。

1? 材料與方法

1.1? 材料

以蛋白質組分和含量不同的2個水稻品種‘16-17（谷蛋白前體聚合物明顯，含量高），‘16-20（谷蛋白前體聚合物含量低）作為試驗材料。

1.2? 方法

1.2.1? 種植方法? 將試驗材料于2019年7月9日播種，濕潤育秧;7月21日移栽到水田中，長至開始出現分蘗;8月25日移至水培溶液中，采用溫室塑料缽栽培，塑料缽的規格為口徑20 cm，高30 cm，每缽裝2 kg干凈的細沙，然后放入裝滿營養液的培養池中，置于溫室大棚中培養，直至成熟。營養液（國際水稻水培營養液）分為4個處理，分別為CK（N含量為2800 μmol/L，S含量為80 μmol/L），N（N含量為3640 μmol/L，S含量為80 μmol/L），S（N含量為2800 μmol/L，S含量為260 μmol/L），N+S（N含量為3640 μmol/L，S含量為260 μmol/L）。其中，S含量80 μmol/L是水稻生長所需S元素的臨界值含量，S含量260 μmol/L是水稻生長所需S元素的相對最適含量;N含量2800 μmol/L是國際水稻水培營養液正常含量，N含量3640 μmol/L是在S含量最適的情況下，根據N∶S=14∶1計算所得。成熟后收獲干燥的種子，烘干至恒重后，取稻穗中部顆粒飽滿、形狀大小一致的籽粒，去殼，研磨成細粉，分別進行粗蛋白和蛋白質各組分的提取與測定。以每5粒干燥籽粒為1組，取3組平均值為籽粒單粒重，粗蛋白及蛋白質各組分的提取與測定均為3次重復，以占籽粒干重的百分率為單位[12]。

1.2.2? 粗蛋白提取和測定? 參照Takemoto等[13]的方法略有改動。稱量研磨后的水稻米粉，放入2 mL的離心管中，按照20 mg/ml（W/V）的量加入SDS-Urea蛋白提取液[三羥甲基氨基甲烷（Tris-base）0.37815 g，HCl調節pH到6.8;尿素6 g，十二烷基硫酸鈉（SDS）0.25 g，2-巰基乙醇 1.25 mL，加蒸餾水定容到100mL]。振蕩混勻后放置MX-RL-標準型旋轉混勻儀上旋轉過夜，于14000 r/min、4 ℃進行離心15 min，取上清液用Bradford試劑盒， 測定595 nm處的吸光值，計算粗蛋白含量。

1.2.3? 蛋白質各組分的提取和測定? 參照Takemoto等[13]的方法，有改進。水稻米粉用丙酮脫脂后依次用H2O、1.0 mol/L磷酸緩沖液、60%異丙醇、1%乳酸溶液連續提取清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白及谷蛋白4種不同組分。蛋白質含量測定同粗蛋白的測定方法一致。

1.2.4? SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳? 采用14%的分離膠，5%的濃縮膠。取10～20 ?L蛋白變性液上樣，進行100 V、3 h左右的SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍R-250染色、脫色，成像觀察。

1.2.5? 稻米品質相關測定? 參照國家標準GB/T 1354—2018《大米》和NY/T 593—2013《食用稻品種品質》測定所取樣品的精米長、精米寬、長寬比，堊白米率、糙米率、精米率、整精米率、直鏈淀粉（索萊寶直鏈淀粉試劑盒）和膠稠度等稻米品質的相關指標。

1.2.6? 二硫鍵和巰基含量的測定? 游離巰基（SHF）、總巰基（SHT）和二硫鍵（-S-S-）的含量均采用Beveridge等[14]的方法測定，并稍作改動。稱取60 mg磨碎的米粉溶于10 mL Tris-Gly-8M Urea緩沖液，混勻后10000 ×g離心10 min，取上清液測定游離巰基（SHF）和總巰基（SHT）含量。

游離巰基（SHF）含量：取2 mL上清液于新的離心管，向其加入80 μL Ellmans試劑，然后立即混勻，5 min后在412 nm下測吸光值。總巰基（SHT）含量：取2 mL上清液于新的離心管中，加入0.2% β-巰基乙醇，搖勻靜置2 h，再加入4mL 12%的三氯乙酸（TCA），搖勻后靜置1 h沉淀蛋白質，10000 ×g離心10 min，用12%的TCA溶液洗滌沉淀4次，最后將沉淀溶于3 mL Tris-Gly緩沖液中，取2 mL測吸光值（A412）。計算公式如下：

2? 結果與分析

2.1? 不同營養液對不同水稻品種蛋白組分含量的影響

表1的結果顯示，對不同品種而言，不同處理下蛋白組分的變化不同。與對照相比，‘16-17水稻品種在N、S和N+S的處理下，清蛋白、球蛋白含量均下降，但變化不顯著，而醇溶蛋白和谷蛋白的含量則顯著增加，醇溶蛋白在N處理下由14.22%提高至23.97%。谷蛋白的百分含量在N+S處理下顯著增加，增加了12.97%。N、S處理使醇溶蛋白和谷蛋白含量顯著增加，其他蛋白相對含量降低。對‘16-20水稻品種在不同的處理下，清蛋白含量在N、S處理下顯著降低，百分含量降低了2.52%、2.56%。球蛋白含量在N、S、N+S處理顯著降低，百分含量分別下降2.86%、3.78%和3.69%。醇溶蛋白的百分含量在N+S處理下顯著增加，百分含量增加了3.73%。谷蛋白的百分含量在S和N+S處理下顯著增加，分別增加了17.72%和29.38%。所以在N、S、N+S處理下顯著降低清蛋白和球蛋白含量，顯著增加谷蛋白含量。

2.2? 不同營養液處理改變蛋白的積累形態

表1的結果顯示，不同處理后，2個品種的谷蛋白的相對含量均有所增加。‘16-17經不同處理后，醇溶蛋白相對含量顯著增加，清蛋白和球蛋白變化不顯著。而‘16-20品種的醇溶蛋白在N+S處理下顯著增加，清蛋白、球蛋白的含量均降低。由此可見，對不同水稻品種而言，在不同處理下各組分蛋白的組成變化有很大差異。根據

SDS-PAGE的結果（圖1）顯示，57 kDa谷蛋白前體含量高的‘16-17，各組分蛋白在施加不同的營養液處理時，除了清蛋白和醇溶蛋白有所變化，球蛋白和谷蛋白組分變化沒有明顯差異;而57 kDa谷蛋白前體含量低的‘16-20品種，蛋白含量有明顯的差異，尤其是谷蛋白的含量明顯增加，并且增加了57 kDa及以上多肽的積累。這可能主要是因為谷蛋白的前體物質，即前原蛋白及大分子谷蛋白聚合體的形成具有密切的關系，由于聚合體的形成而造成水稻種子谷蛋白的酸性和堿性2個亞基的含量發生相應的變化，根據結果顯示谷蛋白的α-亞基變化最明顯。并且可以推測，谷蛋白的α-亞基的多肽鏈的組成也極有可能發生了改變。這說明N、S處理后的水稻蛋白，不僅谷蛋白的相對含量發生變化，而且谷蛋白的積累形態、谷蛋白的前體物質前原蛋白及大分子谷蛋白聚合體也明顯地發生了改變。

2.3? 不同營養液處理對稻米品質的影響

根據表2結果顯示，在碾磨品質方面，對于‘16-17和‘16-20，不同處理條件下，糙米率、精米率和整精米率均無顯著性差異。在外觀品質方面，‘16-17和‘16-20的粒長、粒寬和長寬比差異不顯著;另外，不同處理下‘16-17的堊白米率差異不顯著，但是其堊白大小百分比在N處理下顯著降低18%，在S處理下顯著降低18.34%，在N+S處理下顯著降低17.34%，堊白度也顯著降低。‘16-20在施加N處理下堊白米率顯著增加，在S處理下百分含量降低2%但是變化不顯著，在N+S處理下百分含量顯著降低3%，而堊白大小沒有顯著差異，堊白度與CK相比沒有顯著差異，但是N和N+S之間存在差異，N+S處理下的堊白度顯著低于N處理下的堊白度。在蒸煮品質方面，不同處理下，‘16-17的直鏈淀粉含量差異不顯著，‘16-20的直鏈淀粉含量為CK>N>N+S>S，其中在S和N+S處理下直鏈淀粉含量顯著降低，與對照相差分別為2.6%、2.07%。膠稠度方面，‘16-20稻米的膠稠度在不同處理下變化不顯著，但‘16-17的膠稠度在施加N處理下為70 mm，顯著低于其他處理。在營養品質方面，‘16-17的蛋白含量CK

2.4? 不同營養液處理下巰基、二硫鍵的變化

表3的結果顯示，對于‘16-17，總巰基含量為CK

3? 討論

3.1? 不同N、S配施處理下種子蛋白質變化的差異

相關研究[13]發現，谷蛋白和醇溶蛋白作為水稻貯藏蛋白的主要成分，分別積累在2種不同的蛋白體PB-II和PB-I中。為了達到水稻稻米蛋白與不同品質性狀間的完美結合，需要我們精準掌握各個水稻品種的不同蛋白組分的調節，所以在這方面研究仍有無限可能[15]。一般認為，通過外界施加氮肥、硫肥會明顯提高水稻籽粒中蛋白質及其各組分的相對含量[16-18]。從本研究結果可以看出，施加N、S可以增加水稻蛋白質含量，但不同品種之間又存在明顯差異，‘16-17的種子總蛋白含量增加不顯著，‘16-20的種子總蛋白含量則顯著增加。其次，種子蛋白質各組分隨著N、S的施用在不同品種之間也存在明顯差異，‘16-17在N、S處理下清蛋白、球蛋白變化不顯著，而與之相反的醇溶蛋白和谷蛋白含量顯著增加。這與Ning[19]等的研究結果相同，即外界施加氮素等對醇溶蛋白和谷蛋白含量變化的影響更大。對‘16-20而言，在N、S、N+S的處理下，清蛋白，球蛋白的含量顯著降低，醇溶蛋白沒有的研究結果有所不同，可能是因為‘16-20水稻顯著變化，而谷蛋白的含量顯著增加。這與前人種子的總蛋白和谷蛋白含量增加，而含硫氨基酸主要作用于谷蛋白，故醇溶蛋白的變化不明顯，而清蛋白和球蛋白含量顯著降低，這方面的變化需要進一步深入研究。從電泳圖和蛋白組分測定的結果可見，‘16-20的總蛋白和各組分蛋白更容易受外界施加的N、S的影響。

3.2? 不同N、S配施處理下稻米品質的變化

本研究通過水培方法探討了不同N、S配施條件下稻米品質的變化，結果與土壤栽培條件下施加氮、硫肥對稻米品質的影響，既有表現一致的一面，又有表現不一致的一面。李玉影[18]在土壤栽培條件下的研究指出，增施硫肥具有增加稻米蛋白質含量、降低直鏈淀粉含量的作用;王爽等[17]提出外界增加氮肥施用量可以提高水稻產量，同時增加稻米的碾磨品質和蛋白質含量，降低膠稠度和直鏈淀粉含量，這與本文的水培試驗結果一致。不論是單獨施加N或S的處理，還是N+S配施處理，2個試驗品種的種子蛋白質含量都呈增加的趨勢，特別是‘16-20的種子蛋白質含量更是顯著性地增加。而碾磨品質在不同N、S配施條件無顯著性變化。外觀品質方面，堊白米率、堊白大小和堊白度表現出明顯差異，S或N+S的施用條件下，2個品種的堊白米率和堊白度都有減少，有利于外觀品質的改善，這與陳能等[20]蛋白質含量對稻米的堊白度、堊白米率等質量指標產生不良影響的結果相反，可能是因為該研究的2個水稻品種不屬于高蛋白品種，故其外觀品質較高蛋白品種更優一些。蒸煮品質方面，在S處理下‘16-20品種的直鏈淀粉含量顯著降低，這與陳小倩等[21]的研究結果一致，一般認為在一定范圍內直鏈淀粉含量降低則食味值增加。本研究的結果初步顯示，單獨S處理，以及N+S配施處理，均有利于改善‘16-20的稻米營養品質和外觀品質，對于其他品質的影響還需進一步的研究。

3.3? 含巰基的蛋白與稻米品質的相關性

水稻種子蛋白組分中，谷蛋白和醇溶蛋白都富含半胱氨酸和蛋氨酸，這2個氨基酸都含有自由巰基，這些巰基可以通過分子內或分子外的二硫鍵相互結合而形成較大的蛋白質聚合體[22]，這些蛋白質聚合體進一步與淀粉粒結合形成蛋白質- 淀粉復合體等網絡結構，可能成為影響米飯硬度和黏性等食味品質的主要作用之一[23-24]。本研究結果顯示，施加S處理下游離巰基、總巰基和二硫鍵含量都有所增加，尤其是二硫鍵含量顯著增加的‘16-20的谷蛋白含量也顯著性增加。水稻種子中的谷蛋白和醇溶蛋白的結構和特性主要是由二硫鍵決定的， 并對2種蛋白的結構性和穩定性起著至關重要的作用[25]。硫對水稻種子蛋白質含量的影響主要體現在，施加硫元素能夠增加水稻蛋白質含量，并對蛋白質的積累形態產生影響，這種影響主要集中在含巰基的谷蛋白和醇溶蛋白的質和量的變化上。在施硫處理下，變化最明顯的是谷蛋白亞基、57 kDa谷蛋白前體和大分子蛋白聚合物的含量和形態，從SDS- PAGE電泳圖譜上看，施S處理下這幾種形態的蛋白質含量顯著增加，尤其是‘16-20的57 kDa的大分子的形成和含量的增加很明顯，100 kDa左右的蛋白條帶變化較明顯，并且醇溶蛋白的變化也有一定差異。硫處理下，2個品種的清蛋白和球蛋白含量降低、谷蛋白含量增加，而醇溶蛋白含量因品種的不同而有不同的變化，這一差異可能影響水稻種子蛋白組分的變化，而水稻蛋白組分間比例的變化也可影響蛋白質最終的結構性質、功能性等的改變，從而導致稻米品質的改變。

此外，根據稻米品質相關分析顯示，變化最明顯的為淀粉，并且有關研究[26-27]表明蛋白質與淀粉、淀粉與脂質之間的相互作用、結合構成的某種網絡結構對大米的蒸煮、糊化和膠稠度等都有影響，對大米的性質造成改變。正是由于這種含巰基的蛋白質結構對蛋白質、淀粉、脂質作用而復合形成的結構，直接或間接地影響稻米的蒸煮食味品質的質地和大米的營養品質。

4? 結論

研究結果顯示，氮、硫的施用可以顯著改變水稻種子蛋白質含量，使蛋白質的4種組分的含量和形態也發生明顯變化。硫的施用可以顯著增加總巰基含量和二硫鍵含量，導致某些富含含硫氨基酸的蛋白質組分合成增加，并通過二硫鍵結合，使水稻種子蛋白質的結構和積累形態發生改變。同時氮、硫配施也改變了稻米的品質性狀，同時其變化程度與品種有一定的關系，結果顯示品種‘16-17和‘16-20間的差異也很大。另外，在硫的施用下而引起的水稻種子蛋白質成分和積累形態的改變與稻米的品質性狀有密切關系。

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責任編輯：崔麗虹