土壤解磷菌RQ3-01的篩選及初步鑒定

趙詠梅, 李婷雨, 阮 倩

(西安文理學院 生物與環境工程學院，西安 710065)

植物的生長發育和光合作用都離不開磷元素，磷是植物體內有機化合物的主要成分，是植物生長必需的營養元素之一。植物中的磷主要來源于土壤，然而，土壤中大部分的磷與Ca2+,Fe2+,Fe3+,Al3+結合形成難溶性磷酸鹽，致使植物無法直接利用[1]。據報道，我國有75%的耕地土壤缺磷，并且95%以上的磷為無效形式，在農業生產中就極易導致化肥過量施用，并且磷肥的當季利用率僅為5%至25%，這使得土壤營養失調，土壤品質性質退化，農作物產量降低，形成惡性循環。近年來，利用植物根際與磷循環相關的生物學系統來調節植物根際磷的有效性，特別是利用解磷微生物來活化土壤難溶性磷，已成提高土壤磷的有效性研究熱點。土壤中存在大量的具有解磷能力的微生物，能夠將難溶性的磷酸鹽如磷礦粉轉化為水溶性磷，提高土壤中的可溶性磷含量，從而改善植物磷素營養，提高作物產量[2]。所以，從土壤中分離具有解磷功效的菌株制備成微生物肥料，提高土壤對磷的利用率，具有重要的意義。筆者研究了從土壤中提取鑒定解磷菌株的過程，為開發新型微生物肥料提供了參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 樣本材料 西安文理學院附近地表以下10 cm取土樣各100 g，混勻，烘干，保藏于實驗室備用。

1.1.2 儀器 熒光顯微鏡(OLYMPUS-CX31)、超凈工作臺、電子天平、立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器(LDZX-40Ⅱ型)、隔水式電熱恒溫培養箱(PYX-OHS-40X-0)、分光光度計、數顯恒溫水浴振蕩器(SHA-C)及常規實驗用具。

1.2 方法

1.2.1 培養基的制備 營養瓊脂培養基：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，NaCl5 g，瓊脂15 g，加蒸餾水至1 000 mL，pH7.2-7.4，滅菌備用。

無機磷培養基：葡萄糖10 g，瓊脂20 g，NaCl 0.3 g，MgSO40.3 g，KCl0.3 g，MnSO4·4H2O 0.03 g，Ca3(PO4)212 g，FeSO4·7H2O 0.03 g，(NH4)2SO40.5 g，加蒸餾水至1 000 mL,pH7.2，滅菌備用。

有機磷液體培養基(蒙金娜培養基)(g·L-1)：葡萄糖10.00 g，(NH4)2SO40.5g，MgSO4·7H2O 0.3 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3g，FeSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·H2O 0.03 g，CaCO35 g，加蒸餾水至1 000 mL，pH7.0～7.5，滅菌。將培養基融化冷卻至50°C后，立即加入蛋黃液(蛋黃液為0.8%無菌生理鹽水與雞蛋黃1∶1配制)，每100 mL的基礎培養基加卵黃稀釋液3～4 mL作為有機磷源，混勻后分裝于培養皿內凝固。

1.2.2 菌種的初篩和純化 稱取10 g土樣過100目篩，置入90 mL無菌水中，于室溫搖床上100 rpm搖動30 min,得10倍稀釋懸液；稀釋制備10-3，10-5倍土壤懸液；用無菌管分別吸取10，10-1，10-3，10-5倍稀釋土壤懸液各0.1 mL，置于無機磷平板培養基，在30℃下培養3～7 d后，對產生了溶磷圈的單菌落進行分離純化；鏡檢并編號，4℃保藏備用。

1.2.3 透明圈法菌種的復篩 將初篩出來的菌株接種于無機磷固體培養基平板，置于28℃培養3 d，將產生透明圈的菌株用直尺測量溶磷圈直徑(D)和菌落直徑(d)，并根據是否產生溶磷圈以及D/d值得大小確定菌株的解磷能力。

1.2.4 鉬銻抗比色法測定RQ3-01菌株可溶性磷含量 將RQ3-01菌株以3%～6%的接種量接入150 mL液體磷發酵培養基，以空白種子液為對照，置于30℃、180 rpm培養5～7 d；再制備鉬銻貯存溶液、鉬銻抗顯色劑、5 mg·L-1磷標準溶液備用；按照鉬銻抗比色法繪制磷標準曲線。對RQ3-01菌株的可溶性磷含量進行測定，以空白種子參比液調節儀器零點，進行比色測定，讀取OD700nm吸光度,計算含量[3]。

1.2.5 RQ3-01菌株的形態學和生化鑒定 將篩選出來的菌株RQ3-01在營養瓊脂培養基上培養，觀察菌落生長特征，記錄其形狀、大小、顏色、透明度、邊緣特征等[4]；常規方法進行革蘭氏染色，吖啶橙染色；直接將配置好的1%鹽酸四甲基對苯二胺滴加于被檢菌落上，采用菌落法進行氧化酶試驗，觀察菌落的變化[5～7]。

1.2.6 RQ3-01菌株的分子生物學鑒定 將RQ3-01菌株送到上海生工生物工程股份有限公司進行16SrDNA的擴增與測序。

2 結果

2.1 菌種的初篩和純化結果

通過在無機磷培養基上培養篩選出9株解無機磷能力比較強的菌株，分別為：RQ3-01、RQ1-01、RQ1-02、RQ2-02、RQ2-03、RQ3-02、RQ3-03、RQ4-01、RQ4-02。

2.2 菌種解磷能力的復篩和鑒定

用透明圈法進行復篩，產生透明圈的菌株為解無機磷細菌，用直尺測量溶磷圈直徑(D)和菌落直徑(d),計算9株菌株的D/d值大小，結果如表1所示，RQ3-01菌株溶磷圈最大，D/d值達到1.78，故其解無機磷能力最強。

表1 透明圈法測定各種菌株的解磷能力

2.3 RQ3-01菌株的可溶性磷含量測定

用鉬銻抗比色法測定RQ3-01菌株的可溶性磷含量，確定其解無機磷能力。繪制的磷標準曲線見圖1和圖2，得到公式y=0.5731x(R2=0.9992)，y=0.5417x(R2=0.9958)，計算出發酵液中的有效磷含量。與磷標準曲線進行對照分析可知，RQ3-01菌株解無機磷能力達到22.313 mg·L-1，有機磷能力達到：20.266 mg·L-1。

圖1 無機磷標準曲線

2.4 RQ3-01菌株的形態學和生化鑒定結果

RQ3-01菌株在無機磷培養基上呈白色，黏稠狀，菌落周圍有透明圈，形狀不規則，邊緣平滑。革蘭氏染色后RQ3-01菌株為紅色，為革蘭氏陰性菌。經過吖啶橙染色在熒光顯微鏡下可以觀察到RQ3-01菌株為無核細菌，呈桿狀，不形成芽孢，分泌黃綠色熒光色素并發出熒光。氧化酶試驗中菌株由白色變為紫色，呈陽性。

圖2 有機磷標準曲線

圖3 RQ3-01菌株在熒光顯微鏡(40x)下的形態

2.5 RQ3-01菌株的分子生物學鑒定

對RQ3-01菌株進行16SrDNA的擴增和測序，檢測表明其堿基對為1391bp(圖4)；經核糖體數據庫比對顯示，RQ3-01菌株與熒光假單胞菌相似度為100%。故RQ3-01菌株是熒光假單胞菌。

圖4 RQ3-01菌株的測序結果

3 討論

土壤中的微生物是土壤肥力的核心，其不僅數量巨大，且種類極多，部分種類對土壤氮、磷和鉀等養分的轉化和供給起到非常重要的作用。因此，對土壤中解鉀菌、解磷菌和固氮菌的研究越來越得到學者們的重視。實驗經過多級篩選從土壤中分離得到熒光假單胞菌RQ3-01，其解無機磷和有機磷能力分別達到22.313 mg·L-1和20.266 mg·L-1，實驗證明，RQ3-01有較強的無機和有機磷耐受力。

在已知的植物根際有益微生物中，熒光假單胞菌是種群數量較多的細菌種類之一。研究表明，熒光假單胞菌營養需要相對簡單，能夠利用植物根系分泌物中的營養迅速定殖，其菌劑對多種植物病原菌有很強的拮抗作用，具有繁殖速度快，適應能力強，易于人工培養等優點，更適合現代社會對農業生產及有害生物防治的需求[8～9]。本實驗分離得到的熒光假單胞菌RQ3-01，不僅本身具有繁殖速度快，適應能力強，易于人工培養等優點，且具有良好的解磷效果，但其對有機磷農藥的耐受性和其遺傳穩定性有待作更深入的研究。