南非葉中總黃酮提取工藝的優(yōu)化

雷燕妮，張小斌，陳書存，陳冬平，李多偉

(1.商洛學(xué)院，陜西秦嶺特色生物資源產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，陜西 商洛 726000；2.商洛市中醫(yī)醫(yī)院，陜西 商洛 726000；3.西安宇沐生物技術(shù)研究院有限公司，陜西 西安 710001；4.西北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710069)

扁桃斑鳩菊的別名為南非葉，扁桃斑鳩菊(VernoniaamygdalinaDel.)是菊科斑鳩菊屬的一種植物，其原產(chǎn)于熱帶非洲，最多見于西非。近年來(lái)從新加坡、馬來(lái)西亞移植到中國(guó)，在臺(tái)灣、廣東、海南等地均有引種，其葉既可入藥，也可作為蔬菜食用[1～3]。南非葉具有抗氧化、抗腫瘤等多種生理活性與其含有豐富的有效成分如生物堿、皂苷、黃酮類、萜類、類固醇、香豆素類、酚酸類、木酚素、蒽醌類、氧雜蒽酮和倍半萜等有密切相關(guān)受到醫(yī)藥科研工作者的親睞[4,5]。黃酮類是南非葉中主要的一種成分，南非葉黃酮類成分對(duì)乳腺癌、肝癌、白血病、宮頸癌等疾病的治療方面己經(jīng)取得一定的成果，主要采用了多種靶向、多樣化通道等方法。隨著對(duì)南非葉藥用價(jià)值研究的不斷深人，南非葉在臨床上的應(yīng)用前景將越來(lái)越廣闊。

南非葉總黃酮在藥品、保健品中的應(yīng)用已廣泛展開，為使南非葉總黃酮在生產(chǎn)中得到充分的利用，我們擬以南非葉總黃酮的含量作為實(shí)驗(yàn)指標(biāo)，采用單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化南非葉中總黃酮的提取工藝[6,7]，為生產(chǎn)企業(yè)開發(fā)利用南非葉奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 材料

南非葉購(gòu)于大荔鐮塬農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，李智選研究員(西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物教研室)鑒定為菊科斑鳩菊屬植物扁桃斑鳩菊(VernoniaamygdalinaDel.)。

1.2 試劑及藥品

對(duì)照品蘆丁購(gòu)于成都德思特生物技術(shù)有限公司；NaOH、NCl、乙醇、甲醇、NaNO2、Al(NO3)3等化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 儀器

HH.S21-4型數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋(上海博訊)、RE201旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(鄭州市申研儀器設(shè)備有限公司)、SHB-IIIA循環(huán)水式真空泵(林茂科技(北京)有限公司)、BSA224S-CW電子天平(深圳市林濤儀器有限公司),JIDI-6D臺(tái)式低速大容量離心機(jī)(廣州吉迪儀器有限公司)、i8雙光束紫外可見分光光度計(jì)(濟(jì)南海能儀器股份有限公司)；HA-300超聲萃取器(北京恒奧德儀器儀表有限公司)、實(shí)驗(yàn)室小型真空干燥箱(上海和晟儀器科技有限公司)、XC-2500Y型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(永康市沃美戶外用品有限公司)等。

2 實(shí)驗(yàn)及結(jié)果分析

2.1 南非葉中總黃酮含量的測(cè)定

采用紫外可見分光光度計(jì)法測(cè)定南非葉中總黃酮的含量[8]。

2.2 南非葉提取總黃酮的單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 南非葉總黃酮提取方法及提取溶劑的選擇 工藝設(shè)計(jì)：粉碎南非葉過(guò)3號(hào)篩，精密稱取粗粉5 g，4份，按1∶12料液比分別加入55%乙醇溶液、75%乙醇溶液、95%乙醇溶液和水各60 mL于燒瓶中，熱回流提取120 min，過(guò)濾，濾液定容，對(duì)溶液中總黃酮的含量進(jìn)行測(cè)定，采用紫外可見分光光度計(jì)法，測(cè)定結(jié)果見表1。

另取過(guò)3號(hào)篩粉碎的南非葉，精密稱取粗粉5 g，4份，按1∶12料液比分別加入55%乙醇溶液、75%乙醇溶液、95%乙醇溶液和水各60 mL于燒瓶中，超聲(20kHz)提取60 min，過(guò)濾，濾液定容，對(duì)溶液中總黃酮的含量進(jìn)行測(cè)定，采用紫外可見分光光度計(jì)法，測(cè)定結(jié)果見表1。

表1 不同提取方法、不同溶劑南非葉總黃酮的提取效果(n=3)

實(shí)驗(yàn)對(duì)南非葉中總黃酮提取率的影響進(jìn)行研究，采用了不同提取方法、不同提取溶劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在超聲提取法中，提取能力為水<95%乙醇溶液<55%乙醇溶液<75%乙醇溶液，75%乙醇溶液提取能力明顯優(yōu)于55%乙醇溶液；在熱回流提取法中，提取能力為水<95%乙醇溶液<55%乙醇溶液<75%乙醇溶液，75%乙醇溶液提取能力明顯優(yōu)于55%乙醇溶液；超聲法對(duì)南非葉總黃酮的提取效果略優(yōu)于熱回流法對(duì)南非葉總黃酮的提取，在本實(shí)驗(yàn)中，筆者以75%乙醇溶劑作為提取溶劑。

2.2.2 總黃酮提取的單因素實(shí)驗(yàn) 取過(guò)3號(hào)篩粉碎的南非葉，精密稱取粗粉5 g，4份，在不同的提取時(shí)間、不同的料液比和不同的提取次數(shù)下用75%乙醇溶液進(jìn)行超聲提取，過(guò)濾，濾液定容，對(duì)溶液中總黃酮的含量的測(cè)定，采用紫外可見分光光度計(jì)法，通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果判斷最佳的提取條件。

不同料液比對(duì)南非葉提取總黃酮的效果

取過(guò)3號(hào)篩粉碎的南非葉，精密稱取粗粉5 g，4份，按料液比為1∶20、1∶16、1∶12、1∶8分別加入75%乙醇溶液各100 mL、80 mL、60 mL、40 mL，超聲提取60 min，2次，過(guò)濾，濾液定容，溶液中總黃酮的含量的測(cè)定采用紫外可見分光光度法，測(cè)定結(jié)果見表2。

不同提取時(shí)間對(duì)南非葉提取總黃酮的效果

取過(guò)3號(hào)篩粉碎的南非葉，精密稱取粗粉5 g，4份，按料液比1∶16加入75%乙醇溶液各80 mL，超聲提取30 min、45 min、60 min、75 min，2次，過(guò)濾，濾液定容，溶液中總黃酮的含量的測(cè)定采用紫外可見分光光度法，測(cè)定結(jié)果見表2。

不同提取次數(shù)對(duì)南非葉提取總黃酮的效果

取過(guò)3號(hào)篩粉碎的南非葉，精密稱取粗粉5g，4份，按料液比1:16加入75%乙醇溶液各80ml，超聲提取60min，1次、2次、3次、4次，過(guò)濾，濾液定容，溶液中總黃酮的含量的測(cè)定采用紫外可見分光光度法，測(cè)定結(jié)果見表2。

表2 不同料液比、不同提取時(shí)間和不同提取次數(shù)對(duì)南非葉提取總黃酮含量的結(jié)果比較(n=3)

表2可以看出：在相同條件下，超聲波提取隨料液比的提高提取率在增加， 1∶16料液比后超過(guò)總黃酮的含量增加幅度變小，分析其原因是溶劑量的加大提高了溶液濃度差，利于物質(zhì)的傳質(zhì)，1∶16料液比后總黃酮的溶出度基本上達(dá)到平衡，所以當(dāng)料液比增加時(shí)，總黃酮的含量沒(méi)有明顯的增加，所以確定了采用超聲提取時(shí)，料液比為1∶16；在相同條件下，當(dāng)提取時(shí)間的延長(zhǎng)時(shí)，超聲波提取率也相應(yīng)在增加，不過(guò)當(dāng)超聲60 min后，提取率卻呈緩慢增加的趨勢(shì)，分析其原因是超聲波的空化作用可以在較短時(shí)間內(nèi)達(dá)到較高的提取率，隨后由于濃度差的降低提取率增加緩慢。由于超聲提取時(shí)間的增加，會(huì)使生產(chǎn)成本提高，所以建議把超聲提取的時(shí)間進(jìn)行控制，不要超過(guò)60 min；在相同條件下，當(dāng)提取次數(shù)增加時(shí)，超聲波提取率也有所提高，可是當(dāng)超聲提取2次以后，提取率卻呈緩慢增加的趨勢(shì)，分析其原因是超聲波的空化作用可以在較短時(shí)間內(nèi)達(dá)到較高的提取率，隨后由于物質(zhì)基本被浸出，提取率增加緩慢。由于增加超聲提取次數(shù)，會(huì)使生產(chǎn)成本大幅度提高，所以提取2次為最佳的超聲提取次數(shù)。

2.3 南非葉提取總黃酮正交實(shí)驗(yàn)

以2.2南非葉提取總黃酮單因素實(shí)驗(yàn)不同的提取時(shí)間、不同的料液比和不同的提取次數(shù)下實(shí)驗(yàn)結(jié)果為參考，為探討各工藝參數(shù)之間相互交叉的相互影響，用正交實(shí)驗(yàn)的四因素三水平來(lái)研究確定總黃酮超聲提取的最佳工藝參數(shù)。

正交實(shí)驗(yàn)總黃酮超聲提取正交表L9(34)及結(jié)果見表3，直觀分析總黃酮超聲提取得率結(jié)果見表4，方差分析總黃酮超聲提取結(jié)果見表5。

表4 總黃酮超聲提取得率直觀分析結(jié)果

表5 總黃酮超聲提取得率方差分析結(jié)果

按正交表L9(34)設(shè)計(jì)安排，取過(guò)3號(hào)篩粉碎的南非葉，精密稱取粗粉5 g，9份，按料液比為1:8、1:12、1:16，分別加入55%乙醇溶液、75%乙醇溶液和95%乙醇溶液各40 mL、60 mL和80 mL，超聲提取45 min、60 min、75 min，過(guò)濾，濾液定容，溶液中總黃酮的含量的測(cè)定采用紫外可見分光光度法，測(cè)定結(jié)果見表3。

表3 總黃酮超聲提取正交表L9(34)及結(jié)果

通過(guò)正交試驗(yàn)表4直觀分析、表5方差分析，影響實(shí)驗(yàn)效果的因素分別是超聲波提取乙醇溶劑濃度、超聲波提取料液比、超聲波提取時(shí)間和超聲波提取次數(shù)。按效益生產(chǎn)原則可確定最佳的提取條件為A2、B2、C2、 D2,即用濃度為75%的乙醇作為提取溶劑，按料液比1∶12超聲波提取2次，每次60 min。

2.4 南非葉提取總黃酮驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

取過(guò)3號(hào)篩粉碎的南非葉，精密稱取粗粉200 g，3份，按料液比1∶12，加入75%乙醇溶液各2 400 mL，超聲提取60 min，2次，過(guò)濾，濾液再經(jīng)過(guò)減壓濃縮，成為膏樣狀態(tài)，真空干燥，溶液中總黃酮的含量的測(cè)定采用紫外可見分光光度法，測(cè)定結(jié)果見表6。

表6 南非葉提取總黃酮驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=3)

南非葉提取總黃酮驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)南非葉總黃酮的提取，采用醇超聲提取時(shí)，所得總黃酮含量提取率較高，操作簡(jiǎn)單，工藝穩(wěn)定。

3 討論

(1)超聲波提取有助于有效成分的溶出與釋放是由于空化作用對(duì)細(xì)胞膜的破壞以及超聲波提取對(duì)提取液的不斷振蕩有助于溶質(zhì)的擴(kuò)散所致。本實(shí)驗(yàn)研究超聲波提取60 min，提取2次可有效的提高南非葉總黃酮的提取率。

(2)本實(shí)驗(yàn)通過(guò)超聲提取的單因素實(shí)驗(yàn)及正交實(shí)驗(yàn)對(duì)南非葉提取總黃酮進(jìn)行工藝優(yōu)化,確定出最佳提取工藝參數(shù)為：用料液比為1∶12的75%乙醇溶劑超聲提取60min，提取2次。此工藝具有南非葉提取總黃酮操作簡(jiǎn)單、省溶劑、省時(shí)等優(yōu)點(diǎn)。

(3)超聲提取具有提取溫度低、提取效率高、溶劑用量少、省時(shí)等諸多優(yōu)點(diǎn)，尤其是在提取熱敏性物質(zhì)中作用明顯，本實(shí)驗(yàn)為南非葉工業(yè)化超聲提取總黃酮生產(chǎn)提供可借鑒的實(shí)驗(yàn)參數(shù)。