南非葉中總黃酮提取工藝的優化

雷燕妮，張小斌，陳書存，陳冬平，李多偉

(1.商洛學院，陜西秦嶺特色生物資源產業技術研究院，陜西 商洛 726000；2.商洛市中醫醫院，陜西 商洛 726000；3.西安宇沐生物技術研究院有限公司，陜西 西安 710001；4.西北大學 生命科學學院，陜西 西安 710069)

扁桃斑鳩菊的別名為南非葉，扁桃斑鳩菊(VernoniaamygdalinaDel.)是菊科斑鳩菊屬的一種植物，其原產于熱帶非洲，最多見于西非。近年來從新加坡、馬來西亞移植到中國，在臺灣、廣東、海南等地均有引種，其葉既可入藥，也可作為蔬菜食用[1～3]。南非葉具有抗氧化、抗腫瘤等多種生理活性與其含有豐富的有效成分如生物堿、皂苷、黃酮類、萜類、類固醇、香豆素類、酚酸類、木酚素、蒽醌類、氧雜蒽酮和倍半萜等有密切相關受到醫藥科研工作者的親睞[4,5]。黃酮類是南非葉中主要的一種成分，南非葉黃酮類成分對乳腺癌、肝癌、白血病、宮頸癌等疾病的治療方面己經取得一定的成果，主要采用了多種靶向、多樣化通道等方法。隨著對南非葉藥用價值研究的不斷深人，南非葉在臨床上的應用前景將越來越廣闊。

南非葉總黃酮在藥品、保健品中的應用已廣泛展開，為使南非葉總黃酮在生產中得到充分的利用，我們擬以南非葉總黃酮的含量作為實驗指標，采用單因素實驗和正交實驗，優化南非葉中總黃酮的提取工藝[6,7]，為生產企業開發利用南非葉奠定理論基礎。

1 材料與儀器

1.1 材料

南非葉購于大荔鐮塬農業發展有限公司，李智選研究員(西北大學生命科學學院植物教研室)鑒定為菊科斑鳩菊屬植物扁桃斑鳩菊(VernoniaamygdalinaDel.)。

1.2 試劑及藥品

對照品蘆丁購于成都德思特生物技術有限公司；NaOH、NCl、乙醇、甲醇、NaNO2、Al(NO3)3等化學試劑均為國產分析純。

1.3 儀器

HH.S21-4型數顯電熱恒溫水浴鍋(上海博訊)、RE201旋轉蒸發器(鄭州市申研儀器設備有限公司)、SHB-IIIA循環水式真空泵(林茂科技(北京)有限公司)、BSA224S-CW電子天平(深圳市林濤儀器有限公司),JIDI-6D臺式低速大容量離心機(廣州吉迪儀器有限公司)、i8雙光束紫外可見分光光度計(濟南海能儀器股份有限公司)；HA-300超聲萃取器(北京恒奧德儀器儀表有限公司)、實驗室小型真空干燥箱(上海和晟儀器科技有限公司)、XC-2500Y型高速萬能粉碎機(永康市沃美戶外用品有限公司)等。

2 實驗及結果分析

2.1 南非葉中總黃酮含量的測定

采用紫外可見分光光度計法測定南非葉中總黃酮的含量[8]。

2.2 南非葉提取總黃酮的單因素實驗

2.2.1 南非葉總黃酮提取方法及提取溶劑的選擇 工藝設計：粉碎南非葉過3號篩，精密稱取粗粉5 g，4份，按1∶12料液比分別加入55%乙醇溶液、75%乙醇溶液、95%乙醇溶液和水各60 mL于燒瓶中，熱回流提取120 min，過濾，濾液定容，對溶液中總黃酮的含量進行測定，采用紫外可見分光光度計法，測定結果見表1。

另取過3號篩粉碎的南非葉，精密稱取粗粉5 g，4份，按1∶12料液比分別加入55%乙醇溶液、75%乙醇溶液、95%乙醇溶液和水各60 mL于燒瓶中，超聲(20kHz)提取60 min，過濾，濾液定容，對溶液中總黃酮的含量進行測定，采用紫外可見分光光度計法，測定結果見表1。

表1 不同提取方法、不同溶劑南非葉總黃酮的提取效果(n=3)

實驗對南非葉中總黃酮提取率的影響進行研究，采用了不同提取方法、不同提取溶劑，結果發現在超聲提取法中，提取能力為水<95%乙醇溶液<55%乙醇溶液<75%乙醇溶液，75%乙醇溶液提取能力明顯優于55%乙醇溶液；在熱回流提取法中，提取能力為水<95%乙醇溶液<55%乙醇溶液<75%乙醇溶液，75%乙醇溶液提取能力明顯優于55%乙醇溶液；超聲法對南非葉總黃酮的提取效果略優于熱回流法對南非葉總黃酮的提取，在本實驗中，筆者以75%乙醇溶劑作為提取溶劑。

2.2.2 總黃酮提取的單因素實驗 取過3號篩粉碎的南非葉，精密稱取粗粉5 g，4份，在不同的提取時間、不同的料液比和不同的提取次數下用75%乙醇溶液進行超聲提取，過濾，濾液定容，對溶液中總黃酮的含量的測定，采用紫外可見分光光度計法，通過實驗結果判斷最佳的提取條件。

不同料液比對南非葉提取總黃酮的效果

取過3號篩粉碎的南非葉，精密稱取粗粉5 g，4份，按料液比為1∶20、1∶16、1∶12、1∶8分別加入75%乙醇溶液各100 mL、80 mL、60 mL、40 mL，超聲提取60 min，2次，過濾，濾液定容，溶液中總黃酮的含量的測定采用紫外可見分光光度法，測定結果見表2。

不同提取時間對南非葉提取總黃酮的效果

取過3號篩粉碎的南非葉，精密稱取粗粉5 g，4份，按料液比1∶16加入75%乙醇溶液各80 mL，超聲提取30 min、45 min、60 min、75 min，2次，過濾，濾液定容，溶液中總黃酮的含量的測定采用紫外可見分光光度法，測定結果見表2。

不同提取次數對南非葉提取總黃酮的效果

取過3號篩粉碎的南非葉，精密稱取粗粉5g，4份，按料液比1:16加入75%乙醇溶液各80ml，超聲提取60min，1次、2次、3次、4次，過濾，濾液定容，溶液中總黃酮的含量的測定采用紫外可見分光光度法，測定結果見表2。

表2 不同料液比、不同提取時間和不同提取次數對南非葉提取總黃酮含量的結果比較(n=3)

表2可以看出：在相同條件下，超聲波提取隨料液比的提高提取率在增加， 1∶16料液比后超過總黃酮的含量增加幅度變小，分析其原因是溶劑量的加大提高了溶液濃度差，利于物質的傳質，1∶16料液比后總黃酮的溶出度基本上達到平衡，所以當料液比增加時，總黃酮的含量沒有明顯的增加，所以確定了采用超聲提取時，料液比為1∶16；在相同條件下，當提取時間的延長時，超聲波提取率也相應在增加，不過當超聲60 min后，提取率卻呈緩慢增加的趨勢，分析其原因是超聲波的空化作用可以在較短時間內達到較高的提取率，隨后由于濃度差的降低提取率增加緩慢。由于超聲提取時間的增加，會使生產成本提高，所以建議把超聲提取的時間進行控制，不要超過60 min；在相同條件下，當提取次數增加時，超聲波提取率也有所提高，可是當超聲提取2次以后，提取率卻呈緩慢增加的趨勢，分析其原因是超聲波的空化作用可以在較短時間內達到較高的提取率，隨后由于物質基本被浸出，提取率增加緩慢。由于增加超聲提取次數，會使生產成本大幅度提高，所以提取2次為最佳的超聲提取次數。

2.3 南非葉提取總黃酮正交實驗

以2.2南非葉提取總黃酮單因素實驗不同的提取時間、不同的料液比和不同的提取次數下實驗結果為參考，為探討各工藝參數之間相互交叉的相互影響，用正交實驗的四因素三水平來研究確定總黃酮超聲提取的最佳工藝參數。

正交實驗總黃酮超聲提取正交表L9(34)及結果見表3，直觀分析總黃酮超聲提取得率結果見表4，方差分析總黃酮超聲提取結果見表5。

表4 總黃酮超聲提取得率直觀分析結果

表5 總黃酮超聲提取得率方差分析結果

按正交表L9(34)設計安排，取過3號篩粉碎的南非葉，精密稱取粗粉5 g，9份，按料液比為1:8、1:12、1:16，分別加入55%乙醇溶液、75%乙醇溶液和95%乙醇溶液各40 mL、60 mL和80 mL，超聲提取45 min、60 min、75 min，過濾，濾液定容，溶液中總黃酮的含量的測定采用紫外可見分光光度法，測定結果見表3。

表3 總黃酮超聲提取正交表L9(34)及結果

通過正交試驗表4直觀分析、表5方差分析，影響實驗效果的因素分別是超聲波提取乙醇溶劑濃度、超聲波提取料液比、超聲波提取時間和超聲波提取次數。按效益生產原則可確定最佳的提取條件為A2、B2、C2、 D2,即用濃度為75%的乙醇作為提取溶劑，按料液比1∶12超聲波提取2次，每次60 min。

2.4 南非葉提取總黃酮驗證實驗

取過3號篩粉碎的南非葉，精密稱取粗粉200 g，3份，按料液比1∶12，加入75%乙醇溶液各2 400 mL，超聲提取60 min，2次，過濾，濾液再經過減壓濃縮，成為膏樣狀態，真空干燥，溶液中總黃酮的含量的測定采用紫外可見分光光度法，測定結果見表6。

表6 南非葉提取總黃酮驗證實驗結果(n=3)

南非葉提取總黃酮驗證實驗結果表明，對南非葉總黃酮的提取，采用醇超聲提取時，所得總黃酮含量提取率較高，操作簡單，工藝穩定。

3 討論

(1)超聲波提取有助于有效成分的溶出與釋放是由于空化作用對細胞膜的破壞以及超聲波提取對提取液的不斷振蕩有助于溶質的擴散所致。本實驗研究超聲波提取60 min，提取2次可有效的提高南非葉總黃酮的提取率。

(2)本實驗通過超聲提取的單因素實驗及正交實驗對南非葉提取總黃酮進行工藝優化,確定出最佳提取工藝參數為：用料液比為1∶12的75%乙醇溶劑超聲提取60min，提取2次。此工藝具有南非葉提取總黃酮操作簡單、省溶劑、省時等優點。

(3)超聲提取具有提取溫度低、提取效率高、溶劑用量少、省時等諸多優點，尤其是在提取熱敏性物質中作用明顯，本實驗為南非葉工業化超聲提取總黃酮生產提供可借鑒的實驗參數。