生乳中嗜冷菌的快速檢測方法驗證及運用

□ 簡凱樂 李 炳 孔令輝 熊在輝 曾德琛 新希望昆明雪蘭牛奶有限責(zé)任公司

1 嗜冷菌的定義及危害

1.1 定義

牛乳擠出后，經(jīng)冷卻處理降溫到2～4 ℃，能抑制大部分的細菌生長，但部分細菌在低溫條件下也能生長，這類細菌即為低溫菌，低溫菌又包括嗜冷菌和耐冷菌，嗜冷菌又分為專性嗜冷菌和兼性嗜冷菌。專性嗜冷菌最適生長溫度一般為15 ℃，最高不超過20 ℃，0 ℃時也能生長繁殖。兼性嗜冷菌最適生長溫度為20 ℃，0～5 ℃時也能生長繁殖。

1.2 危害

生乳中嗜冷菌的含量高易導(dǎo)致常溫牛奶產(chǎn)品在貨架期1—2月時出現(xiàn)蛋白熱穩(wěn)定性下降或呈粘稠狀，口感發(fā)苦或其他異味[1—2]。嗜冷菌在生長繁殖過程中會產(chǎn)生脂肪酶和蛋白酶。目前，保質(zhì)期較長的牛奶產(chǎn)品經(jīng)超高溫UHT設(shè)備處理能將原料奶中的嗜冷菌殺滅，但其產(chǎn)生的脂肪酶和蛋白酶仍會有10%的殘留存活，產(chǎn)品在貨架期儲存1～2月過程中脂肪酶和蛋白酶會分解產(chǎn)品中的脂肪和蛋白質(zhì)導(dǎo)致出現(xiàn)苦味、分層和結(jié)塊等現(xiàn)象。

2 快速檢測方法的驗證

2.1 驗證目的

NY/T 1331—2007法和Soleris實時光電微生物快速檢測方法同時對樣品進行檢測，驗證生乳嗜冷菌結(jié)果的一致性[3—5]。

2.2 材料與方法

2.2.1 儀器與設(shè)備

Soleris實時光電微生物快速儀；Soleris試 劑 瓶，NF—TVC；無 菌 吸管；磷酸鹽緩沖液；生化培養(yǎng)箱：（6.5±0.5）℃；水浴鍋：（45±1）℃；冰箱；無菌培養(yǎng)皿，直徑90 mm；MPC瓊脂；0.85%生理鹽水；不同菌含量、至少5個梯度的生乳樣本。

2.3 檢測方法

2.3.1 對照方法

NY/T 1331—2007乳與乳制品嗜冷菌的檢測，分別將平板擺放在冰箱和培養(yǎng)箱6.5 ℃條件下培養(yǎng)。

2.3.2 驗證方法

Soleris實時光電微生物快速檢測方法步驟為：無菌移取1 mL上述原奶樣品，加入Soleris嗜冷菌檢測試劑瓶，上下顛倒2～3次混勻，將試劑瓶蓋擰緊后上機進行檢測。Soleris實時光電微生物快速儀設(shè)備檢測參數(shù)設(shè)置見表1。

表1 Soleris實時光電微生物快速儀設(shè)備檢測參數(shù)

2.4 結(jié)果與分析

據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖得原奶嗜冷菌標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：以冰箱培養(yǎng)結(jié)果為參照：Logcfu=—0.152 2x+7.332 8，相關(guān)系數(shù)r=0.804；以培養(yǎng)箱培養(yǎng)結(jié)果為參照：Logcfu=—0.137 5x+7.120 7，相關(guān)系數(shù)r=0.857。用Soleris實時光電微生物快速儀設(shè)備獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線對實驗結(jié)果進行分析，儀器檢測結(jié)果與冰箱內(nèi)培養(yǎng)結(jié)果與培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)的平板結(jié)果的符合率（≤1 Log）分別為96%和88%。具體分析數(shù)據(jù)見表2。

2.5 討論

對于生乳中嗜冷菌的檢測，Soleris儀器在設(shè)置16 ℃條件下測試結(jié)果與冰箱內(nèi)培養(yǎng)、培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)的平板計數(shù)結(jié)果相關(guān)性良好（與冰箱培養(yǎng)計數(shù)結(jié)果吻合度高達96%，與培養(yǎng)箱培養(yǎng)計數(shù)結(jié)果吻合度為88%），由表2數(shù)據(jù)可得同一設(shè)定條件下冰箱培養(yǎng)結(jié)果和培養(yǎng)箱培養(yǎng)結(jié)果偏離程度不超1.0的吻合度為92%，soleris測試結(jié)果完全可滿足生乳嗜冷菌的定量檢測要求。

相比于NY/T 1331—2007方法6.5 ℃培養(yǎng)10 d出具結(jié)果的檢測周期，Soleris實時光電微生物快速檢測在確定生乳中嗜冷菌的數(shù)量上具有顯著優(yōu)勢，可在40 h內(nèi)獲得精確的定量結(jié)果，最快可在16 h內(nèi)獲得結(jié)果。

3 生產(chǎn)過程原料奶驗收及使用的預(yù)防控制

3.1 原料奶驗收標(biāo)準(zhǔn)

GB 19301—2010中雖然沒有對生乳中嗜冷菌進行要求，但T/DAC 003—2017對學(xué)生飲用奶生牛乳中有嗜冷菌≤1×104cfu/mL的要求。結(jié)合目前實際生產(chǎn)運用情況，當(dāng)嗜冷菌≤20×104cfu/mL時用于長保質(zhì)期產(chǎn)品，當(dāng)嗜冷菌≤40×104cfu/mL時用于短保質(zhì)期的產(chǎn)品生產(chǎn)未出現(xiàn)產(chǎn)品壞包的現(xiàn)象。

3.2 檢測方法運用

檢驗對象為外省奶車及近期嗜冷菌檢測數(shù)量較高的生乳。對每次到廠運輸距離超400 km以上的原料奶單獨使用快檢方法進行檢測，同時使用平板方法進行檢測對比。

3.3 判定依據(jù)及方法

當(dāng)天檢測的樣品在16～18 h進行結(jié)果觀察，設(shè)備未出具檢測結(jié)果的則可初步判定為嗜冷菌在萬級以下，可用于常溫產(chǎn)品的正常生產(chǎn)。15 h內(nèi)出具結(jié)果的按照出具結(jié)果情況進行判定是否可用于常溫產(chǎn)品的生產(chǎn)。如果結(jié)果＞40×104CFU/mL的不用于長保質(zhì)期的產(chǎn)品生產(chǎn)。當(dāng)檢測結(jié)果出現(xiàn)異常時需要根據(jù)平時整體的檢測數(shù)據(jù)進行分析檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，平板法進行驗證。通過嗜冷菌快檢的運用，提前將生乳中嗜冷菌含量較高的原料進行分級使用，更好的保障貨架期內(nèi)的產(chǎn)品質(zhì)量，給消費者提供更好更優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品。

表2 Soleris實時光電微生物快速檢測結(jié)果