生乳中嗜冷菌的快速檢測方法驗證及運用

□ 簡凱樂 李 炳 孔令輝 熊在輝 曾德琛 新希望昆明雪蘭牛奶有限責任公司

1 嗜冷菌的定義及危害

1.1 定義

牛乳擠出后，經冷卻處理降溫到2～4 ℃，能抑制大部分的細菌生長，但部分細菌在低溫條件下也能生長，這類細菌即為低溫菌，低溫菌又包括嗜冷菌和耐冷菌，嗜冷菌又分為專性嗜冷菌和兼性嗜冷菌。專性嗜冷菌最適生長溫度一般為15 ℃，最高不超過20 ℃，0 ℃時也能生長繁殖。兼性嗜冷菌最適生長溫度為20 ℃，0～5 ℃時也能生長繁殖。

1.2 危害

生乳中嗜冷菌的含量高易導致常溫牛奶產品在貨架期1—2月時出現蛋白熱穩定性下降或呈粘稠狀，口感發苦或其他異味[1—2]。嗜冷菌在生長繁殖過程中會產生脂肪酶和蛋白酶。目前，保質期較長的牛奶產品經超高溫UHT設備處理能將原料奶中的嗜冷菌殺滅，但其產生的脂肪酶和蛋白酶仍會有10%的殘留存活，產品在貨架期儲存1～2月過程中脂肪酶和蛋白酶會分解產品中的脂肪和蛋白質導致出現苦味、分層和結塊等現象。

2 快速檢測方法的驗證

2.1 驗證目的

NY/T 1331—2007法和Soleris實時光電微生物快速檢測方法同時對樣品進行檢測，驗證生乳嗜冷菌結果的一致性[3—5]。

2.2 材料與方法

2.2.1 儀器與設備

Soleris實時光電微生物快速儀；Soleris試 劑 瓶，NF—TVC；無 菌 吸管；磷酸鹽緩沖液；生化培養箱：（6.5±0.5）℃；水浴鍋：（45±1）℃；冰箱；無菌培養皿，直徑90 mm；MPC瓊脂；0.85%生理鹽水；不同菌含量、至少5個梯度的生乳樣本。

2.3 檢測方法

2.3.1 對照方法

NY/T 1331—2007乳與乳制品嗜冷菌的檢測，分別將平板擺放在冰箱和培養箱6.5 ℃條件下培養。

2.3.2 驗證方法

Soleris實時光電微生物快速檢測方法步驟為：無菌移取1 mL上述原奶樣品，加入Soleris嗜冷菌檢測試劑瓶，上下顛倒2～3次混勻，將試劑瓶蓋擰緊后上機進行檢測。Soleris實時光電微生物快速儀設備檢測參數設置見表1。

表1 Soleris實時光電微生物快速儀設備檢測參數

2.4 結果與分析

據繪制的標準曲線圖得原奶嗜冷菌標準曲線方程為：以冰箱培養結果為參照：Logcfu=—0.152 2x+7.332 8，相關系數r=0.804；以培養箱培養結果為參照：Logcfu=—0.137 5x+7.120 7，相關系數r=0.857。用Soleris實時光電微生物快速儀設備獲得的標準曲線對實驗結果進行分析，儀器檢測結果與冰箱內培養結果與培養箱內培養的平板結果的符合率（≤1 Log）分別為96%和88%。具體分析數據見表2。

2.5 討論

對于生乳中嗜冷菌的檢測，Soleris儀器在設置16 ℃條件下測試結果與冰箱內培養、培養箱內培養的平板計數結果相關性良好（與冰箱培養計數結果吻合度高達96%，與培養箱培養計數結果吻合度為88%），由表2數據可得同一設定條件下冰箱培養結果和培養箱培養結果偏離程度不超1.0的吻合度為92%，soleris測試結果完全可滿足生乳嗜冷菌的定量檢測要求。

相比于NY/T 1331—2007方法6.5 ℃培養10 d出具結果的檢測周期，Soleris實時光電微生物快速檢測在確定生乳中嗜冷菌的數量上具有顯著優勢，可在40 h內獲得精確的定量結果，最快可在16 h內獲得結果。

3 生產過程原料奶驗收及使用的預防控制

3.1 原料奶驗收標準

GB 19301—2010中雖然沒有對生乳中嗜冷菌進行要求，但T/DAC 003—2017對學生飲用奶生牛乳中有嗜冷菌≤1×104cfu/mL的要求。結合目前實際生產運用情況，當嗜冷菌≤20×104cfu/mL時用于長保質期產品，當嗜冷菌≤40×104cfu/mL時用于短保質期的產品生產未出現產品壞包的現象。

3.2 檢測方法運用

檢驗對象為外省奶車及近期嗜冷菌檢測數量較高的生乳。對每次到廠運輸距離超400 km以上的原料奶單獨使用快檢方法進行檢測，同時使用平板方法進行檢測對比。

3.3 判定依據及方法

當天檢測的樣品在16～18 h進行結果觀察，設備未出具檢測結果的則可初步判定為嗜冷菌在萬級以下，可用于常溫產品的正常生產。15 h內出具結果的按照出具結果情況進行判定是否可用于常溫產品的生產。如果結果＞40×104CFU/mL的不用于長保質期的產品生產。當檢測結果出現異常時需要根據平時整體的檢測數據進行分析檢測結果的準確性，平板法進行驗證。通過嗜冷菌快檢的運用，提前將生乳中嗜冷菌含量較高的原料進行分級使用，更好的保障貨架期內的產品質量，給消費者提供更好更優質的產品。

表2 Soleris實時光電微生物快速檢測結果