馬鈴薯LINC4206及其靶基因StDFR的克隆與StDFR的生物信息學分析

吳萬億，張 毅，張 潔，董靜靜，唐銳敏，賈小云，張紅梅

（1.山西農業大學生命科學學院，山西太谷030801；2.山西農業大學農學院，山西太谷030801）

馬鈴薯（Solanum tuberosumL.）是全球第四大重要的糧食作物[1]，僅次于水稻、小麥和玉米，是食品和工業加工的重要原料來源[2]，其中，紫肉馬鈴薯的塊莖中積累了豐富的花青素，是開發功能性食品的理想資源[3]。

花青素因其具有自由基清除能力，具有抗氧化、抗衰老、抗腫瘤和免疫活性調節等作用[4-5]，作為植物類黃酮生物合成的主要次生代謝產物，隨pH值不同使花、果實等器官呈現不同顏色[5-6]。花青素的生物合成發生在細胞質內質網中，從苯丙氨酸開始，經過多次酶促反應、甲基化、糖基化和?；揎椇筠D運到液泡或細胞壁中儲存[7]。這一過程由眾多的結構基因、調控基因和其他調控因子參與。關于結構基因編碼的酶的催化作用，已在多種植物中有了深入研究。研究發現，二氫黃酮醇4-還原酶（DFR）是花青素生物合成途徑中的一個關鍵酶，通過與還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸鹽（NADPH）共同作用，選擇性地催化二氫櫟皮黃酮（DHQ）、二氫堪非醇（DHK）和二氫楊梅黃酮（DHM）形成不同類型的花青素[8-9]，最終使植物葉片、花、果實呈現不同顏色。LOU等[10]研究表明，麝香蘭中DFR催化DHM使其花色呈現藍色，而在草莓[11]中DFR催化DHK使其果實呈現紅色。過表達橙花龍膽GlaDFR1和GlaDFR2基因的轉基因煙草花色加深[12]。

長鏈非編碼RNA（lncRNA）是一類長度大于200 nt，沒有長的開放閱讀框，不具有蛋白編碼能力或編碼能力很低的非編碼RNA[13]。隨著高通量測序技術的發展，越來越多的lncRNA被不斷發現。它們可以通過多種方式產生，在轉錄或轉錄后水平以順式、反式作用的方式調控其下游基因的表達[14]。目前，已經發現一些lncRNA廣泛參與植物的整個生命活動過程[15-18]。近年來，在少數植物中發現，一些lncRNA參與了花青素的合成調控[19-22]。迄今為止，對于參與花青素合成的lncRNA的深入研究大多集中在地上器官（花、葉、果），但紫肉馬鈴薯塊莖中的花青素是在黑暗條件下合成積累的[17]。目前，關于lncRNA對馬鈴薯塊莖中花青素的合成調控作用尚未報道。

山西農業大學生命科學學院分子生物學課題組前期對希森8號和晉16這2種不同薯肉顏色的馬鈴薯塊莖進行lncRNA轉錄組高通量測序，篩選到在2個品種中差異表達的lncRNA-LINC4206，通過構建lncRNA-mRNA共表達網絡預測到StDFR為其靶基因。本研究克隆了LINC4206及其靶基因StDFR，采用生物信息學方法分析了StDFR基因的編碼蛋白，并利用RT-qRCR進行差異表達分析，旨在為后續解析lncRNA調控花青素生物合成的作用機制奠定基礎，同時也為研究lncRNA對地下器官中花青素合成調控機制提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試馬鈴薯品種為希森8號（紫皮紫心）和晉16（黃皮黃心）。其中，希森8號由山東省樂陵市西森馬鈴薯產業有限公司提供，晉16保存于山西農業大學農學院。將4周齡的組培苗在溫室（22±1）℃、光14 h/暗10 h條件下培養，經馴化移栽大田。3個月后，采收新鮮塊莖進行lncRNA測序。每個樣品3個生物學重復，每個生物學重復來自于3個生長狀況良好且一致的馬鈴薯塊莖。

植物RNA提取試劑盒購自北京華越洋生物公司，Prime ScriptTMRT reagent Kit反轉錄試劑盒、SYBR ScriptTMRT reagent KitⅡ試劑盒、DNA Marer和pMDTM19-T Vector試劑盒均購自TaKaRa公司，2×Taq Master Mix購自康為世紀公司，DNA片段純化試劑盒和質粒提取試劑盒購自Axygen公司，氨芐霉素購自索萊寶公司。大腸桿菌感DH5α菌株由山西農業大學生命科學學院分子生物學實驗室保存。

1.2 試驗方法

1.2.1LINC4206與StDFR基因的克隆 根據課題組lncRNA轉錄組數據庫提供的LINC4206、StDFR的核苷酸序列，分別設計克隆引物，引物序列如表1所示。

表1 LINC4206及StDFR的克隆引物

根據CTAB法[23]提取希森8號馬鈴薯塊莖基因組DNA進行PCR擴增LINC4206，擴增總體系為50μL：2×Taq Master Mix 25μL，10μmol/LLINC4206-PF/PR各2μL，DNA 3μL，ddH2O 18μL；擴增程序為：94℃預變性2 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環；72℃終延伸2 min。按華越洋多酚多糖植物RNA提取試劑盒說明書提取RNA，cDNA的合成參照Prime ScriptTMRT reagent Kit反轉錄試劑盒說明書進行PCR擴增St DFR，擴增總體系為50μL：2×Taq Master Mix 25μL，10μmol/LStDFR-PF/PR各2μL，cDNA 3μL，ddH2O 18μL；擴增程序為：94℃2 min；94℃30 s，58℃1 min，72℃1 min，35個循環；72℃2 min。將LINC4206及StDFR的PCR產物進行回收純化，分別連接至載體pMDTM19-T并轉化到大腸桿菌感受態細胞中，涂布于含有氨芐霉素的LB固體培養基37℃過夜培養；次日挑取單克隆鑒定，經過PCR菌液檢測送至上海生工公司進行測序。其余菌液及質粒保存于-80℃，備用。

1.2.2St DFR基因的生物信息學分析 通過使用表2在線軟件對StDFR基因進行生物信息學分析。

表2 生物信息學分析所用軟件

1.2.3LINC4206與StDFR基因的表達模式分析根據課題組lncRNA轉錄組數據庫提供的LINC4206及StDFR的核苷酸序列分別設計特異性引物（表3），分別以晉16和希森8號的塊莖cDNA為模板，參照實時熒光定量試劑盒說明書，通過BIO-RAD CFX 96熒光定量儀對LINC4206及StDFR這2個基因在2個不同品種馬鈴薯塊莖中的表達水平進行RT-qPCR分析，同時以StEF1α為內參基因，每個樣品3個技術重復。

表3 試驗中用到的定量特異性引物

2 結果與分析

2.1 LINC4206和StDFR基因的克隆

LINC4206-PF/PR和StDFR-PF/PR為克隆引物，分別以希森8號基因組DNA和cDNA為模板，進行PCR反應，經過瓊脂糖凝膠電泳檢測，在2條泳道上各得到了一條特異性條帶，且2條帶大小不一（圖1-A），長度符合預期，初步判斷為目的片段；將這2條目的條帶回收、連接載體、轉化大腸桿菌、挑單克隆后進行菌落PCR，經檢測，2個目的片段大小與前面結果一致（圖1-B、C）。將陽性菌落擴繁，提取質粒DNA，測序可知，序列長度分別為816、1149 bp。

2.2 StDFR生物信息學分析

經生物信息學軟件分析，結果顯示（圖2），StDFR基因編碼的蛋白分子量為42469.78，分子式為C1912H2987N491O565S18，原子總數為5973，等電點為5.71，不穩定系數為31.77，總平均親水性為-0.171，是一個親水性穩定蛋白，且無跨膜結構域和信號肽。亞細胞定位預測StDFR蛋白最有可能被定位于細胞質、細胞質膜。

二級結構主要由無規則卷曲、α-螺旋、β折疊和延伸鏈構成，其中，無規則卷曲和α-螺旋占比最多，分別為43.98%和36.65%，β折疊和延伸鏈占比較少，分別為6.28%和13.09%（圖3）。三級結構預測顯示（圖4），建模模板為2c29.1.A，在第18—341氨基酸處建模，序列相似度為71.99%，模型覆蓋率達到87%。保守結構域預測發現，在氨基酸序列的第20—259位殘基之間有一個典型的差相異構化結構域（epimerase）；StDFR基因編碼NAD（P）結合的折疊超家族蛋白質，屬于短鏈脫氫酶/還原酶家族。

在NCBI下載甜櫻桃（Prunus avium）、野草莓（Fragaria vesca）、大豆（Glycine soja）、辣椒（Capsicum annuum）、龍眼（Dimocarpus longan）、水稻（Oryza sativa）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）、煙草（Nicotiana tabacum）、番茄（Solanum lycopersicum）、茄子（Solanum melongena）、馬鈴薯（Solanum tuberosum）等多種植物的DFR蛋白序列，運用MEGA構建進化樹，分析發現，馬鈴薯與同屬于茄科的番茄、茄子、煙草聚集在一起，說明其與這3個物種的親緣關系較近，與茄子最近（圖5）。

2.3 LINC4206與StDFR基因的表達模式分析

為了探究LINC4206在馬鈴薯塊莖花青素的生物合成中是否發揮作用，利用RT-qPCR方法分析了LINC4206及StDFR在晉16和希森8號塊莖中的表達情況，結果如圖6所示，LINC4206和StDFR在這2個品種中均有表達，且均在希森8號中的表達量較高，在晉16中表達量較低，推斷LINC4206可能靶向作用于StDFR進而正調控馬鈴薯花青素的合成積累。

3 結論與討論

近年來，一些lncRNA被發現參與植物生長、花果發育、脅迫響應等生物學過程。例如，擬南芥COOLAIR和COLDAIR通過抑制開花基因來實現快速開花轉變[16-17]；水稻LDMAR通過調控DNA甲基化導致雄性不育[18]；TAS3通過氮響應以促進側根發育[24]；番茄lncRNA1459與番茄果實成熟相關，lncRNA1459的缺失會抑制乙烯的產生和番茄紅素的積累[25]；lnc39042可以與靶基因SLP100協同作用提高番茄的抗病性。毋若楠等[26]研究表明，將lncRNA在擬南芥中過表達后，擬南芥的耐旱性提高。在少數植物中也發現lncRNA參與了花青素的生物合成。

本課題組通過前期對紫色肉質和黃色肉質馬鈴薯塊莖的轉錄組測序，基于lncRNA-mRNA的相關性構建共表達網絡，篩選出在晉16和希森8號中差異表達的lncRNA，并進一步在希森8號中成功克隆得到了LINC4206及其靶基因StDFR，其片段大小分別為816、1149 bp。采用RT-qPCR對LINC4206和StDFR差異表達分析結果表明，LINC4206可能促進StDFR的表達，進而正調控馬鈴薯花青素合成積累。楊拓[21]研究發現，光可以誘導MLNC3.2和MLNC4.6結合miRNA156a，進而減少其對SPL2-like和SPL33的剪切，從而促進蘋果中花青素的積累。趙亞楠等[23]研究發現，Mul-CHSAS通過抑制Mul-CHS的表達進而負調控花青素合成。此外，ZHANG等[19]通過高通量測序技術不僅鑒定出了在沙棘果實發育過程中差異表達的lncRNA，并且發現了LNC1和LNC2通過抑制SPL9和MYB114的表達負調控花青素的合成。

本研究對StDFR進行保守結構域預測發現，其有一個典型的epimerase結構域，該基因編碼NAD（P）結合的折疊超家族蛋白，屬于短鏈脫氫酶/還原酶家族。系統進化樹分析表明，同為雙子葉植物的馬鈴薯StDFR，與同屬雙子葉植物的茄子SmDFR、番茄SlDFR和煙草NtDFR有較近的親緣關系；但與同屬茄科的矮牽牛的蛋白結構不同，StDFR蛋白定位于細胞質、細胞質膜，無跨膜結構域和信號肽，而矮牽牛蛋白定位于線粒體上，具有信號肽和轉移肽，屬于跨膜蛋白，說明DFR在同一茄科不同屬的植物中特性可能有所不同。

本研究對StDFR的生物信息學分析和差異表達分析表明，LINC4206可能促進靶基因StDFR的表達而正調控花青素合成，為研究lncRNA在調控地下器官中花青素的生物合成方面提供了參考，對培育專用于各種高附加值產品的馬鈴薯新品種具有指導意義。但是本研究僅對lncRNA及其靶基因進行了RT-qPCR分析，對于LINC4206及其靶基因StDFR在花青素合成中的調控機制還尚未知，后續需要分別構建LINC4206和StDFR的過表達載體和缺失表達載體及遺傳轉化等功能驗證，以便深入研究LINC4206在馬鈴薯花青素合成中的調控作用。