Cry1Ia蛋白N端信號肽對其蛋白表達量的影響

郭俊佩，劉 璇，韓阜志，高建華，史宗勇

（山西農業大學生命科學學院，山西太谷030801）

Cry蛋白是應用最廣泛的Bt殺蟲蛋白，對雙翅目、鞘翅目和膜翅目等害蟲具有特異、高效的毒殺作用[1]，Cry蛋白的結構和殺蟲機制已被廣泛研究[2]。Cry殺蟲蛋白主要以伴孢晶體的形式存在于蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）細胞中[3]，其N端含有3個與殺蟲相關的結構域[4-7]，為Cry蛋白的主要功能域，僅有這3個結構域的Cry蛋白的分子質量約為65 ku[8-9]；另外，部分Cry蛋白C端還有一段長肽，主要幫助Cry蛋白形成晶體結構，這類蛋白的分子質量大小約為135 ku。對于分子質量約65 ku的Cry蛋白而言，形成伴孢晶體需要其他蛋白的幫助，如Cry2Aa蛋白需要在cry2Aa操縱子表達的Orf2蛋白（29.4 ku）幫助下才能形成伴孢晶體[10]；cry11A操縱子中orf3基因編碼一個20 ku的蛋白質，可充當分子伴侶，輔助Cry11A形成伴孢晶體[11]。

Cry1I類蛋白結構較為特殊，這類蛋白無C端長肽，在Bt細胞中表達后不形成伴孢晶體[12]，由N端信號肽介導釋放到胞外[8，13]。原核細胞中，常見分泌信號肽一般分為3個部分，即N區、H區和C區[14-15]。其中，N區由帶正電荷氨基酸組成，可與脂質雙層帶負電荷的磷酸基團相互作用，進而促進蛋白質的有效轉運；H區是中性氨基酸組成的疏水功能區，決定信號肽的構象及其對細胞膜的取向、信號肽的裂解以及影響蛋白加工和轉運效率；C區由多個極性氨基酸組成且含有信號肽酶作用位點，其酶切作用位點較保守，切割效率決定蛋白質的分泌水平。

Cry1類蛋白通常只對某一種昆蟲有特異殺蟲活性，而Cry1I分泌型蛋白對大多數鱗翅目和鞘翅目昆蟲均有殺蟲活性，作為廣譜殺蟲蛋白具有良好的應用潛力[16]。如Cry1Ia蛋白能夠毒害鱗翅目和鞘翅目昆蟲[17]，Cry1Ie蛋白對亞洲玉米螟[18]、小菜蛾[19]和棉鈴蟲[20]等具有較高的殺蟲活性。此外，KOSTICHKA等[12]、SCHNEPF等[21]分析認為，Cry1Ia蛋白的N端信號肽Iasp中第1～10個氨基酸為N區，第11～16個氨基酸為H區，剩余29個氨基酸為C區。GAO等[22]將Iasp融合到綠色熒光蛋白eGFP的N端形成融合熒光蛋白IeGFP，其表達量顯著高于eGFP，繼而增強了宿主細胞的熒光強度，說明信號肽融合是基因表達量增強的原因之一，可見Iasp功能非常重要。

為深入了解Iasp完整性對Cry1Ia自身表達量的影響，本研究將Iasp的N端分別截取5、10、13、16、24、32、44、73個氨基酸，構建一系列Iasp缺失突變體，分析N端氨基酸不同程度缺失對Cry1Ia蛋白原核表達的影響，旨在為解析Iasp功能奠定一定理論基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試菌株為大腸桿菌（Escherichia coli）TG1菌株及BL21 Star（DE3）感受態細胞。

所用試劑為DNA標準分子量1 kb Plus DNA Ladder，購自中科瑞泰（北京）生物科技有限公司；AxyGEN質粒小提試劑盒、DNA回收試劑盒、限制性內切酶BamH Ⅰ/SacⅠ、蛋白質標準分子量PageRuler Prestained Protein Ladder，均購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 表達載體的構建 在含有50μg/mL氨芐青霉素的LB固體培養基上劃線接種Tp304-1Ia[23]菌株的菌液，37℃條件下培養10 h。將單克隆接種于LB液體培養基（含有50μg/mL的氨芐青霉素），37℃200 r/min培養10 h，提取質粒DNA。

表1 研究所使用的引物

表2 研究所使用的質粒

采用SnapGene DNA軟件設計引物（表1）進行PCR擴增，PCR擴增體系為Green mix 12.5μL，上下游引物各0.5μL，DNA模板0.5μL，加ddH2O至總反應體積25μL。PCR擴增程序為94℃預變性5 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸150 s，35次循環；最后72℃延伸5 min。將擴增產物進行TA克?。╬MD19），測序正確后，用BamHⅠ和SacⅠ限制性內切酶進行酶切，回收后接入pET28aDel線性化載體中，并轉化TG1感受態細胞。將轉化成功的單克隆提取質粒進行酶切鑒定，并將鑒定正確的表達載體分別命名為p28aD-Cry1IaD5、p28aD-Cry1IaD10、p28aD-Cry1IaD13、p28aD-Cry1IaD16、p28aDCry1IaD24和p28aD-Cry1IaD32（表2）。

1.2.2 Cry1Ia蛋白的表達分析 將成功構建的表達載體用熱激法分別轉入大腸桿菌BL21 Star（DE3）感受態細胞，37℃培養10 h。分別將9個菌株的單克隆接種于含有50μg/mL卡那霉素LB液體培養基，37℃培養10 h；按1∶1000轉接至含有50μg/mL卡那霉素的LB液體培養基，繼續培養至OD600值為0.8；加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG），使終濃度為1.0mmol/L，16℃125 r/min誘導6 h。對表達產物進行SDS-PAGE分析。采用Image Lab 6.0.1軟件對蛋白表達結果進行相對定量。

1.2.3cry1Ia基因的mRNA局部結構預測 用RNA structure 6.1預測cry1Ia、cry1IaD5、cry1IaD10、cry1IaD13、cry1IaD16、cry1IaD24、cry1IaD32、cry1I-D44和cry1IaD73基因的起始密碼子附近（-4～+37 nt）核苷酸的二級結構[25]，選擇每個序列具有最低折疊能量的結構進行比較。利用SPSS 23.0對9種蛋白表達量和9種基因的起始密碼子附近核苷酸的二級結構熱穩定性進行相關性分析。

2 結果與分析

2.1 載體的構建及鑒定

研究共使用了Cry1Ia蛋白的8種N端缺失表達載體，其中，p28aD-Cry1IaD5、p28aD-Cry1IaD10、p28aD-Cry1IaD13、p28aD-Cry1IaD16、p28aD-Cry1-IaD24和p28aD-Cry1IaD32等6種表達載體是本研究構建（圖1-A）。通過對8種N端缺失表達載體進行雙酶切鑒定，結果顯示，目的片段的大小與預期一致，表明載體構建成功（圖1-B）。

2.2 N端信號肽缺失對Cry1Ia蛋白表達量的影響

將酶切鑒定正確的表達載體轉化BL21 Star（DE3）感受態細胞原核表達發現，Cry1Ia和8種突變體蛋白均能成功表達，目的蛋白大小與預期一致（圖2、表2）。用Image Lab軟件對圖2中的目的條帶進行相對定量，將Cry1Ia作為對照（表達量記為1），結果發現（表3），Cry1IaD32和Cry1IaD44的表達量最高，分別約為對照Cry1Ia的1.43倍和1.12倍；Cry1IaD13和Cry1IaD16的表達量與對照Cry1Ia持平，分別為對照Cry1Ia的1.04倍和1.07倍；而Cry1IaD5、Cry1IaD10、Cry1IaD24和Cry1IaD73的表達量均低于對照Cry1Ia。說明Cry1Ia的N端信號肽缺失不同程度影響其蛋白表達，但與對照間差異不顯著。

表3 蛋白表達相對定量

2.3 cry1Ia基因的mRNA分析

利用RNA structure 6.1預測了cry1Ia和8種5′端堿基缺失基因的二級結構，結果如圖3所示，cry1IaD24與cry1Ia起始密碼子（-4～+37）附近的核苷酸區域預測二級結構相似，均僅包含一個莖環結構，且雙股螺旋內部僅含有一個GC配對，該結構導致二者熱穩定性接近，ΔG分別為-0.7 kcal/mol和-0.6 kcal/mol；cry1IaD13基因的mRNA也包含一個莖環結構，但雙股螺旋中存在2個GC配對，從而增加了該結構的熱穩定性（ΔG＝-4.0 kcal/mol）；其他幾個突變體基因的二級結構均包含多個莖環結構，其中，cry1IaD5和cry1IaD73莖環結構最多，且GC含量相對較高，熱穩定性也最高。

進一步對Cry1Ia蛋白表達量和對應基因的起始密碼子附近核苷酸的二級結構熱穩定性進行了相關性分析，結果顯示，2個變量間相關系數為0.377，在95%水平下不顯著，所以，2個變量間無顯著相關關系。

3 結論與討論

前期研究表明，Cry1Ia蛋白的N端信號肽Iasp跨膜轉運eGFP蛋白的性能較弱，但是具有作為融合標簽的潛力，可改善多種蛋白，比如eGFP、MMP13和GDF8在大腸桿菌BL21 Star（DE3）中的表達[22]。本試驗為了研究Iasp不同區域對Cry1Ia蛋白表達的影響，分析了8種Iasp的缺失突變體，結果顯示，Cry1Ia蛋白和8種缺失突變體在大腸桿菌中均獲得了較好的表達，且表達產物的大小與預期一致，該結果與前人研究結果一致[22，26]。

本研究用Image Lab軟件對目的條帶進行相對定量，結果發現，Cry1IaD32和Cry1IaD44的表達量高于Cry1Ia，Cry1IaD13和Cry1IaD16的表達量同Cry1Ia基本持平，其余4種蛋白的表達量低于Cry1Ia。但整體而言，Cry1Ia和8種突變體蛋白表達水平差異不大。該結果表明，Cry1Ia蛋白N端氨基酸序列不同程度缺失對Cry1Ia蛋白表達無顯著影響。有研究發現，在原核細胞中蛋白表達量受多種因素影響，其中，SD序列與起始密碼子AUG之間的序列及其長度會影響肽鏈的翻譯效率[27]，二者之間的堿基組成和排列順序通過影響雙股螺旋的結構參數而改變起始密碼子AUG在核糖體中相對角度，進而影響翻譯效率[28]。值得注意的是，起始密碼子附近的核酸序列二級結構的熱穩定也是關鍵因素之一[22，29-30]。前人研究發現，熱穩定性較低的基因蛋白表達水平較高，比如，KUDLA等[29]研究發現，在不同GFP編碼序列的5′端添加一段二級結構熱穩定性低的前導序列，獲得的融合基因高水平表達；GAO等[22]研究發現，iegfp起始密碼子附近核苷酸二級結構的熱力學穩定性低于egfp，而IeGFP蛋白表達量卻高于eGFP。本研究結果表明，熱穩定性從弱到 強 依 次 為Cry1Ia、Cry1IaD24、Cry1IaD32、Cry1IaD10、Cry1IaD44、Cry1IaD13、Cry1IaD16、Cry1IaD73、Cry1IaD5；蛋白表達量從高到低依次為Cry1IaD32、Cry1IaD44、Cry1IaD16、Cry1IaD13、Cry1Ia、Cry1IaD24、Cry1IaD73、Cry1IaD5、Cry1IaD10；關聯性分析發現，二者無顯著相關性。這與前人研究結果不一致[22，29]，可能是由于Cry1Ia信號肽對自身蛋白與其他融合蛋白的影響有所差異，也有可能是由于重復次數有限且缺少轉錄水平和翻譯水平的精確定量。因此，本研究中表達量與mRNA二級結構熱穩定性的關系還需進一步研究。

本研究構建了一系列Cry1Ia蛋白N端信號肽缺失突變體，首次研究了不同程度信號肽缺失對其自身蛋白表達的影響，結果發現，Iasp不同程度缺失影響其蛋白表達，但表達水平差異不大。以上研究結果為進一步探究Iasp的功能奠定了一定理論基礎。