HPLC測定大豆皂苷方法的建立和優化

殷叢叢，李文帥，徐海軍，談美霞，王 敏，趙晉忠，杜維俊，岳愛琴

（1.山西農業大學基礎部，山西太谷030801；2.山西農業大學農學院，山西太谷030801）

大豆（Glycine maxL.Merr.）皂苷是大豆種子中一類重要的次生代謝產物[1]，屬三萜齊墩果酸型皂苷。由大豆皂醇A、皂醇B這2種苷元結合β-D-葡萄糖、β-D-木糖、β-D-半乳糖、β-D-葡萄糖醛酸、α-L-阿拉伯糖、α-L-鼠李糖等6種糖基及其乙酰化糖基組成。依據其苷元的結構差異，分為A類、B類、E類和DDMP類大豆皂苷[2-4]。研究表明，大豆皂苷具有抗癌、抗炎、抗氧化、降低膽固醇、增強免疫和保護肝臟等多種對人體有益的生理功能[5-10]，可開發成藥品和保健品。在植物體中皂苷參與自身的防御反應[11]，使植物具有抗病毒和抗蟲害等抗性[12]，同時它還是一種重要的殺菌劑、發泡劑和穩定劑[13-15]，還可作為高級化妝品和食品的添加劑，具有很大的市場潛力和應用前景[16]。

GESTETNET等采用薄層色譜法分析水解純化后的大豆皂苷，運用重量法測定脫脂豆粕中皂苷含量[17]。AMAROWICZ等采用Lichrosorb RP18柱配制甲醇-丙醇-水-甲酸（32∶4∶63∶0.1）的流動相，在RI檢測器中分析大豆皂苷[17]。黃賢校等[18]以齊墩果酸標準品繪制標準曲線，建立相應的回歸方程，測定大豆總皂苷含量。KRISHNAMURTHY等[19]利用HPLC-ESI-MS（Q）檢測出各類型大豆皂苷的含量。目前，國內外對于大豆皂苷分析尚未建立標準方法，對于檢測大豆皂苷主要采用分光光度法、高效液相色譜法（HPLC）[20]和高效液相色譜-電噴霧串聯質譜法（HPLC-ESI-MS/MS）[21-22]。分光光度法主要是對總大豆皂苷含量進行測定，無法測定大豆樣本的皂苷組成；HPLC法主要是對大豆皂苷的水解產物大豆皂醇A和B進行測定[23]，無法對大豆皂苷進行直接檢測；而HPLC-ESI-MS/MS雖然可以準確測定大豆皂苷各組分含量，但費用昂貴。因此，建立一種操作簡單、測定時間短、準確度高、成本低廉的大豆皂苷檢測方法，對大豆的特異種質資源挖掘和遺傳改良非常重要。

目前，發現的大豆皂苷種類共有54種，最主要有Aa、Ab、Ba、Bb等4種皂苷。筆者利用HPLC法建立和優化測定大豆皂苷Aa、Ab、Ba、Bb的方法，以實現操作簡便、成本低廉、快速、準確測定大豆皂苷成分分析及含量，旨在為大豆皂苷類型的鑒定和含量的測定提供技術基礎。

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器

大豆皂苷標準品Aa（≥98%）、Ab（≥98%）、Ba（≥98%）、Bb（≥98%）、乙腈、冰醋酸均為色譜純。

Agilent 1260高效液相色譜（配二極管陳列檢測器），色譜柱ZORBAX SB-C18（250mm×4.6mm，5μm），30μL定量環，GT200高通量組織振蕩研磨儀（GRINOER，GT200），ZX-LGJ-18真空冷凍干燥機。

1.2 試驗方法

1.2.1 溶液配制

1.2.1.1 樣品溶液的制備 將大豆種子冷凍干燥，球磨儀研磨成粉末，4℃備用。準確稱取0.1 g大豆粉，加1 mL 70%乙醇（含乙酸0.01%），超聲提取10 min，室溫避光浸提24 h，3000 r/min離心10 min，上清液用2倍體積的正己烷萃取脫脂，經0.22μm濾膜過濾后4℃保存備用。

1.2.1.2 標準溶液的制備 準確稱取大豆皂苷標準品Aa、Ab、Ba、Bb各1 mg，分別加入1 mL甲醇，配成1mg/mL的儲備液，于4℃保存備用。

1.2.2 液相色譜條件的優化

1.2.2.1 流動相中乙酸含量的選擇優化 參考ZHAO等[24]色譜條件，設乙酸含量為0、0.05%、0.10%共3個水平進行試驗。

1.2.2.2 檢測波長的選擇優化 據文獻[25]報道，A類和B類皂苷在205、210 nm處有最大吸收，DDMP類在295 nm處有最大吸收。本試驗分別在205、210、295 nm波長下進行檢測，尋找最佳檢測波長。

1.2.2.3 大豆皂苷分型 采用優化后的色譜條件對大豆皂苷標準品Aa、Ab、Ba和Bb進行檢測分析，通過比對保留時間，對大豆樣品皂苷類型進行定性檢測。

1.2.2.4 標準曲線的繪制 將配制好的儲備液逐級稀釋為0.1、0.2、0.4、0.8、1.0mg/mL的標準溶液。按優化后的色譜條件繪制峰面積—質量濃度標準曲線。

1.2.2.5 線性關系及檢測下限的測定 準確吸取混合標準溶液，用甲醇逐級稀釋，信噪比（S/N）為3時對應的質量濃度為檢測下限。

1.2.2.6 精密度及檢出率的測定 取大豆皂苷標準品（Aa、Ab、Ba、Bb）儲備液，用甲醇稀釋為60μg/mL，按優化后的色譜條件進行分析，6次重復，計算精密度及檢出率。

2 結果與分析

2.1 流動相中最佳乙酸體積分數的選擇

從圖1可以看出，流動相中不加乙酸時，大豆皂苷在205 nm處吸收很弱，甚至檢測不到大豆皂苷（圖1-a）；流動相中含有0.05%乙酸時，吸收增強，可以將大豆皂苷色譜峰與噪聲分離（圖1-b）；當乙酸體積分數為0.10%時，背景吸收增強，噪聲增大，基線也出現嚴重波動（圖1-c）。所以，選擇0.05%乙酸的乙腈溶液和0.05%乙酸的超純水溶液作為流動相。

2.2 檢測波長的選擇

由圖2可知，大豆皂苷各組分在波長205 nm處均有較好的吸收峰，檢測效果優于210、295 nm波長。大豆皂苷各組分在波長210 nm處雖均有吸收峰，但吸收強度均低于波長205 nm。波長295 nm時只有DDMP類皂苷有強吸收峰，其他類型大豆皂苷均沒有吸收峰。因此，本試驗選檢測波長為205 nm。

2.3 色譜條件及其適用性分析

由以上試驗結果表明，流動相A為0.05%乙酸乙腈溶液，B為0.05%乙酸超純水溶液；流速1.0 mL/min，檢測波長205 nm；柱溫30℃；進樣量30μL（表1為梯度洗脫程序的最優條件）。在該色譜條件下，對大豆樣品和4種大豆皂苷標準品（Aa、Ab、Ba、Bb）進行檢測，從HPLC-DAD色譜圖可以看出，各色譜峰出峰均勻，分離效果好，并且峰型尖銳，能夠達到分離檢測4種大豆皂苷的目的（圖3、4）。

表1 不同洗脫時間下流動相的體積分數情況 %

由表2可知，樣品中除4號峰（Ab）的分離度為1.21、9號峰（Bb）的分離度為1.29外，各色譜峰之間的分離度均大于2.0，選擇性都接近1.0，多數峰的對稱因子在0.7～0.9，各組分能夠完全分離。說明該方法能夠對大豆皂苷進行分型和定量檢測，滿足同時對多種大豆皂苷組成測定的要求。

表2 樣品中檢測到的大豆皂苷各色譜峰的參數

2.4 定性分析及種質資源篩選

由圖5可知，依據大豆皂苷標準品Aa、Ab的保留時間，對A類大豆皂苷類型進行了檢測，篩選出了只含大豆皂苷Aa或Ab以及同時含有大豆皂苷Aa、Ab的大豆種質資源。

2.5 標準曲線的繪制和檢測下限分析

圖6為4種大豆皂苷標準品（Aa、Ab、Ba、Bb）的標準曲線，樣品中4種大豆皂苷的含量可通過大豆樣品的色譜峰面積進行計算。由表3可知，大豆皂苷標準品（Aa、Ab、Ba、Bb）的回歸方程的線性范圍為100～1000μg/mL，相關系數均接近1。其中，大豆皂苷Aa、Ab的檢測下限為20μg/mL，Ba、Bb的檢測下限為10μg/mL，檢測具有較高靈敏度，可滿足分析要求。

2.6 精密度及檢出率分析

4種大豆標準品（Aa、Ab、Ba、Bb）加料量為60μg/mL，分別對其檢出量進行分析，試驗重復6次，結果顯示（表4），4種大豆標準品（Aa、Ab、Ba、Bb）的加料量與檢出量之間差異不顯著，平均檢出率為89.9%～105.6%，精密度為1.06%～2.31%。表明該方法精密度高，檢出率高。

表3 大豆皂苷標準品線性范圍、相關系數和檢測下限

表4 大豆皂苷標準品的檢出率

3 結論與討論

大豆皂苷結構復雜，組成成分多，又受品種及大豆產地等因素的影響，各自的含量存在差異，很難分離種類完全的大豆皂苷單體作為測試標準品，使得無法有效利用HPLC開展大豆皂苷全部組成和含量的評價工作，成為限制大豆育種工作者深入研究大豆皂苷的瓶頸。以往用分光光度法雖然速度快，但只能測定出大豆皂苷總含量，無法確定大豆皂苷組成及各組成的含量。TLC應用于大豆皂苷檢測，可以快速檢測大豆皂苷組成的變化，且以上方法都不能將檢測樣本中的大豆皂苷快速分離出來。近年來，大豆皂苷單體不斷分離出來，HPLC、HPLC-MS分析測定技術的不斷完善，為育種工作者展開大豆皂苷品質研究提供了技術保證。本研究建立了一種利用HPLC法檢測4種大豆皂苷Aa、Ab、Ba、Bb含量的方法，可為今后大豆種質資源的鑒定和品質育種提供技術支持。受大豆皂苷標準品限制，該方法仍無法實現對全種類皂苷的檢測和分離。下一步計劃對大量大豆樣本進行檢測分析，制備新的以及具有重要研究價值的大豆皂苷標準品，進一步完善HPLC檢測方法，為大豆皂苷的開發以及種質資源的篩選提供手段。

本研究建立了一種操作簡單、檢測時間短、準確度高的大豆皂苷HPLC-DAD檢測方法，在該色譜條件下，采用梯度洗脫，可以對Aa、Ab、Ba、Bb大豆皂苷進行定性定量檢測，大豆皂苷Aa、Ab的檢測下限為20μg/mL，Ba、Bb的檢測下限為10μg/mL，平均檢出率為89.9%～105.6%，精密度為1.06%～2.31%，相關系數均不低于0.997。該檢測方法可在大豆皂苷功能性產品開發以及大豆種質資源篩選等方面發揮重要作用。