微孔板式微生物法與國標(biāo)微生物法測(cè)定 嬰幼兒配方乳粉中泛酸含量的比較

◎ 郭瑩瑩，楊 光，李興霖，王玉芝，王哲明，趙 平

（黑龍江省質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)研究院，黑龍江 哈爾濱 150028）

泛酸屬于水溶性維生素，在體內(nèi)主要以輔酶A形式參與代謝。泛酸是人、動(dòng)物及微生物必需的營養(yǎng)物質(zhì)，作為營養(yǎng)添加劑，被廣泛應(yīng)用于食品中[1-3]。泛酸缺乏時(shí)可能誘發(fā)腦部受損、頭痛、嘔吐、疲勞、食欲不振、舌炎、胃酸缺乏和皮炎等，尤其是在嬰幼兒發(fā)育時(shí)期表現(xiàn)明顯。嬰幼兒配方乳粉作為嬰幼兒攝取營養(yǎng)物質(zhì)的主要來源，各國非常重視，故對(duì)維生素添加量的監(jiān)控十分重要[4-5]。

嬰幼兒配方乳粉中泛酸含量測(cè)定的方法主要是微生物法和高效液相色譜法，而微生物法靈敏度高、受基質(zhì)干擾小，是國家標(biāo)準(zhǔn)及AOAC（美國分析化學(xué)家協(xié)會(huì)）方法測(cè)定嬰幼兒配方乳粉中泛酸含量的指定方法[6]。

微孔板法是利用微生物方法，在微孔板中定量檢測(cè)嬰幼兒配方乳粉中的泛酸含量的方法。相比于國標(biāo)微生物法，微孔板法具有操作簡(jiǎn)便、降低成本、提高工作效率的優(yōu)點(diǎn)[7]。本實(shí)驗(yàn)主要通過采用實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的微孔板式微生物法與國標(biāo)微生物法對(duì)質(zhì)控樣品和不同品牌的市售嬰幼兒配方乳粉中泛酸含量的測(cè)定的比較，來分析實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的微孔板式微生物法在測(cè)定嬰幼兒配方乳粉泛酸含量中的準(zhǔn)確度。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

SQP精密天平（德國Sartorius公司）、KQ5200DE超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）、PB-10pH計(jì)（德國賽多利斯公司）、T6新世紀(jì)紫外分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）、2266潔凈工作臺(tái)（上海拜艾斯）、MX-S渦旋振蕩器（美國Scilogex公司）、HPS-400生化培養(yǎng)箱（哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司）、PHOMO酶標(biāo)儀（鄭州安圖生物股份有限公司）及微量移液器（德國Eppendorf公司）。

1.2 材料與試劑

SRM 1849a質(zhì)控樣品[美國NIST，含量范圍（6.82±0.19）mg/100 g]；不同品牌的5種市售嬰幼兒配方乳粉；Millex-GP一次性無菌濾器（美國Millipore公司）。

植物乳桿菌ATCC 8014（美國Microbiologics公司）；泛酸鈣標(biāo)準(zhǔn)品（99.0%，北京曼哈格生物科技有限公司）；乳酸桿菌瓊脂（美國BD公司）；乳酸桿菌肉湯（美國BD公司）；泛酸測(cè)定培養(yǎng)基（北京路橋公司）；無水乙醇（分析純，天津市天力化學(xué)試劑有限公司）。

1.3 國標(biāo)微生物法

采用《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中泛酸的測(cè)定》（GB 5009.210—2016）[8]第一法微生物法對(duì)質(zhì)控樣品與5種市售不同品牌嬰幼兒配方乳粉中泛酸含量進(jìn)行測(cè)定。每個(gè)樣品進(jìn)行7次平行測(cè)定，計(jì)算平行測(cè)定結(jié)果及結(jié)果間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD。在一個(gè)樣品中加入標(biāo)準(zhǔn)中間液進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，測(cè)定結(jié)果并計(jì)算回收率。

1.4 微孔板式微生物法

1.4.1 測(cè)試菌液的制備

按《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中泛酸的測(cè)定》（GB 5009.210—2016）[8]第一法微生物法中接種液的制備方法制備測(cè)試菌液，并將測(cè)試菌液的透光率在550 nm處調(diào)節(jié)至30%～35%，備用。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

參照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中泛酸的測(cè)定》（GB 5009.210—2016）[8]第一法微生物法中標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度點(diǎn)設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)濃度點(diǎn)，見表1。以各標(biāo)準(zhǔn)濃度點(diǎn)吸光度為橫坐標(biāo)，各標(biāo)準(zhǔn)濃度泛酸含量為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線系列濃度表

1.4.3 培養(yǎng)、測(cè)定與計(jì)算

用8聯(lián)排微量移液器在微孔板的每個(gè)微孔中加入5 μL制備好的植物乳桿菌（ATCC 8014）測(cè)試菌液，再用8聯(lián)排微量移液器移取150 μL已制備泛酸測(cè)定培養(yǎng)基于微孔中，用微量移液器移取150 μL系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液與適當(dāng)稀釋的樣品溶液于指定的微孔中，加液完畢后，用微孔板封口膜封好微孔板，置生化培養(yǎng)箱37 ℃黑暗環(huán)境中培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)后將微孔板充分振蕩混勻，揭開微孔板封口膜，用移液器槍頭去除微孔中表面氣泡，利用酶標(biāo)儀在550 nm波長下讀取各微孔的吸光度。以吸光度為橫坐標(biāo)、泛酸含量為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，參照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中泛酸的測(cè)定》（GB 5009.210—2016）[8]中第一法微生物法的計(jì)算方法計(jì)算樣品泛酸含量。

依據(jù)本方法，對(duì)5種不同品牌市售嬰幼兒配方乳粉和質(zhì)控樣品進(jìn)行泛酸含量測(cè)定，每個(gè)樣品進(jìn)行7次平行測(cè)定，并對(duì)一種樣品進(jìn)行加標(biāo)，測(cè)定并計(jì)算回收率，通過精密度實(shí)驗(yàn)及加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)來評(píng)價(jià)本方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 國標(biāo)微生物法結(jié)果

2.1.1 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

5種不同品牌的市售嬰幼兒配方乳粉及質(zhì)控樣品中泛酸含量的測(cè)定結(jié)果見表2，各樣品結(jié)果間無顯著差異，RSD為1.14%～2.34%，方法重現(xiàn)性較好，精密度較高，且定值質(zhì)控樣品的實(shí)測(cè)值在含量范圍（6.82±0.19）mg/100 g內(nèi)接近于定值，說明國標(biāo)微生物法準(zhǔn)確度較高。

2.1.2 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

對(duì)市售嬰幼兒配方乳粉進(jìn)行泛酸加標(biāo)，采用國標(biāo)微生物法對(duì)其泛酸含量進(jìn)行測(cè)定并計(jì)算回收率，測(cè)定結(jié)果如表3所示，加標(biāo)回收率為97.6%～100.3%，平均回收率為98.96%，RSD為1.10%，回收率接近100%，說明國標(biāo)法的系統(tǒng)誤差小，重復(fù)性好，準(zhǔn)確度高。

表2 國標(biāo)微生物法精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

表3 國標(biāo)微生物法加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

2.2 微孔板式微生物法實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

微孔板式微生物法測(cè)定不同品牌的嬰幼兒配方乳粉和質(zhì)控樣品中泛酸含量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4，各樣品結(jié)果間無顯著差異，RSD為1.34%～2.45%，說明本方法具有良好的重現(xiàn)性，精密度較高，且定值質(zhì)控樣品的實(shí)測(cè)值在含量范圍內(nèi)接近于定值，說明微孔板式微生物法準(zhǔn)確度較高。

表4 微孔板式微生物法精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

2.2.2 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

微孔板式微生物法加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表5所示，回收率為93.2%～106.3%，平均回收率為101.0%，RSD為4.32%，回收率接近100%說明方法的系統(tǒng)誤差小，重復(fù)性好，準(zhǔn)確度高。

表5 微孔板式微生物法加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

2.3 方法結(jié)果比較

采用兩種方法測(cè)定不同品牌的嬰幼兒配方乳粉中泛酸含量的結(jié)果如表6所示，各樣品的泛酸含量結(jié)果的平均值接近，兩方法測(cè)定各樣品結(jié)果經(jīng)F檢驗(yàn)，P＞0.05。采用雙樣本等方差t檢驗(yàn)對(duì)兩方法各樣品結(jié)果進(jìn)行分析P＞0.05，應(yīng)用兩種方法在測(cè)定嬰幼兒配方乳粉中泛酸含量上無顯著差異，說明兩種方法相近，微孔板式微生物法可以替代國標(biāo)微生物法應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室中測(cè)定嬰幼兒配方乳粉中泛酸含量。

表6 方法結(jié)果比較表

3 結(jié)論

通過國標(biāo)微生物法與微孔板式微生物法對(duì)5種市售不同品牌的嬰幼兒配方乳粉及質(zhì)控樣品中泛酸含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明兩種方法的準(zhǔn)確度較高；且兩種方法測(cè)定的每種樣品的7個(gè)平行結(jié)果間的RSD值為1.14%～2.34%與1.34%～2.45%，方法重復(fù)性較好，精密度較高，且平行結(jié)果間均無顯著差異；兩種方法的平均回收率分別為98.96%與101.0%，都接近于100%，說明方法的系統(tǒng)誤差較小。且兩種方法測(cè)定各樣品泛酸含量的結(jié)果較接近，經(jīng)F檢驗(yàn)與t檢驗(yàn)分析，兩方法在測(cè)定嬰幼兒配方乳粉中無顯著差異。結(jié)果表明采用的微孔板式微生物法在測(cè)定嬰幼兒配方乳粉中泛酸含量上與國標(biāo)微生物法具有相同的效果，結(jié)果準(zhǔn)確可靠、方法重現(xiàn)性好、系統(tǒng)誤差小，能夠應(yīng)用于日常嬰幼兒配方乳粉中泛酸含量的測(cè)定中，減少工作量，提高工作效率，降低實(shí)驗(yàn)成本。